Mèsi pou vizite Nature.com. Vèsyon an nan navigatè w ap itilize gen limite CSS sipò. Pou pi bon rezilta, nou rekòmande ke ou itilize yon vèsyon plus nan navigatè ou a (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Nan entre -temps la, asire sipò kontinyèl, nou ap montre sit la san yo pa manier oswa JavaScript.
Kwasans mikwòb nan blesi souvan manifeste poukont li kòm biofilms, ki entèfere ak gerizon ak yo difisil detwi. Nouvo pansman an ajan reklamasyon pou konbat enfeksyon blesi yo, men efikasite antibiofilm yo ak efè geri endepandan enfeksyon yo jeneralman enkoni. Sèvi ak modèl in vitro ak nan vivo biofilm nan Staphylococcus aureus ak Pseudomonas aeruginosa, nou rapòte efikasite nan Ag1+ ion-génération pansman; Ag1+ pansman ki gen ethylenediaminetetraacetic asid ak klori benzetonyòm (Ag1+/EDTA/BC), ak pansman ki gen nitrat ajan (Ag oxysalts). , ki pwodwi Ag1+, Ag2+ ak Ag3+ iyon sa yo konbat biofilm blesi ak efè li sou gerizon. Ag1+ pansman te gen efè minim sou biofilm blesi nan vitro ak nan sourit yo (C57BL/6J). Nan contrast, oksijene sèl AG ak Ag1+/EDTA/BC pansman siyifikativman redwi kantite bakteri solid nan biofilms nan vitro ak demontre yon rediksyon enpòtan nan bakteri ak EPS konpozan nan biofilms blesi sourit. Sa yo pansman te gen efè diferan sou gerizon an nan biofilm ki enfekte ak ki pa biofilm ki enfekte blesi, ak pansman oksijene sèl ki gen plis efè favorab sou reepithelialization, gwosè blesi, ak enflamasyon konpare ak tretman kontwòl ak lòt pansman an ajan. Diferan pwopriyete fizikochimik nan pansman an ajan ka gen efè diferan sou biofilm blesi ak gerizon, ak sa a yo ta dwe konsidere lè chwazi yon abiye pou tretman nan blesi biofilm ki enfekte.
Blesi kwonik yo defini kòm "blesi ki fail pwogrè nan premye etap yo nòmal nan gerizon nan yon fason lòd ak alè" 1. Blesi kwonik kreye yon chay sikolojik, sosyal ak ekonomik pou pasyan yo ak sistèm swen sante a. Anyèl depans NHS sou trete blesi ak komorbidite ki asosye yo estime nan £ 8.3 milya dola nan 2017-182. Blesi kwonik yo tou kounye a yon pwoblèm peze nan Etazini yo, ak Medicare estime pri anyèl la nan trete pasyan ki gen blesi nan $ 28.1 - $ 96.8 milya3.
Enfeksyon se yon gwo faktè ki anpeche geri blesi. Enfeksyon yo souvan manifeste kòm biofilms, ki prezan nan 78% nan ki pa geri blesi kwonik. Biofilms fòme lè mikwo-òganis vin irevèrsibl tache ak sifas yo, tankou sifas blesi, epi yo ka total yo fòme eksetera polymère (EPS)-pwodwi kominote yo. Se biofilm blesi ki asosye ak yon repons enflamatwa ogmante ki mennen ale nan domaj tisi, ki ka retade oswa anpeche geri4. Ogmantasyon nan domaj tisi ka akòz an pati nan ogmante aktivite nan metaloproteinases matris, kolagenaz, elastaz ak espès oksijèn reyaktif5. Anplis, selil enflamatwa ak biofilm yo se tèt yo konsomatè segondè nan oksijèn epi yo ka Se poutèt sa lakòz ipoksi tisi lokal yo, apovri selil nan oksijèn nan vital ki nesesè pou reparasyon tisi efikas6.
Biofilm ki gen matirite yo trè rezistan a ajan antibiotics, ki egzije estrateji agresif pou kontwole enfeksyon biofilm, tankou tretman mekanik ki te swiv pa tretman antibiotics efikas. Paske biofilms ka rapidman rejenerasyon, antibiotics efikas ka diminye risk pou yo re-fòmasyon apre debridasyon chirijikal7.
Silver se de pli zan pli itilize nan pansman antibiotics ak se souvan itilize kòm yon tretman premye-liy pou kwonik blesi ki enfekte. Gen anpil pansman ajan komèsyal ki disponib, chak ki gen yon konpozisyon ajan diferan, konsantrasyon, ak matris baz. Pwogrè nan braslè ajan yo te mennen nan devlopman nouvo braslè an ajan. Fòm metalik an ajan (Ag0) se inaktif; Pou reyalize efikasite antibiotics, li dwe pèdi yon elèktron pou fòme ajan iyonik (Ag1+). Pansman an ajan tradisyonèl gen konpoze an ajan oswa ajan metalik ki, lè ekspoze a likid, dekonpoze yo fòme Ag1+ iyon. Sa yo Ag1+ iyon reyaji ak selil la bakteri, retire elektwon soti nan eleman estriktirèl oswa pwosesis kritik ki nesesè pou siviv. Te teknoloji patante mennen nan devlopman nan yon nouvo konpoze an ajan, Ag oxysalts (Silver nitrat, Ag7NO11), ki se enkli nan pansman blesi. Kontrèman ak ajan tradisyonèl, dekonpozisyon nan oksijèn ki gen sèl pwodui eta an ajan ak pi wo valans (Ag1+, Ag2+ak Ag3+). Etid in vitro yo montre ke konsantrasyon ki ba nan oksijene sèl ajan yo pi efikas pase yon sèl ajan ion (Ag1+) kont bakteri patojèn tankou Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ak Escherichia coli8,9. Yon lòt nouvo kalite abiye an ajan gen ladan engredyan adisyonèl, sètadi ethylenediaminetetraacetic asid (EDTA) ak klori benzetonyòm (BC), ki rapòte bay sib biofilm EPS ak kidonk ogmante pénétration an ajan nan biofilm la. Nouvo teknoloji ajan sa yo ofri nouvo fason pou vize biofilm blesi yo. Sepandan, enpak sa yo antimikrobyen sou anviwònman an blesi ak enfeksyon-endepandan geri enpòtan yo asire yo ke yo pa kreye yon anviwònman blesi favorab oswa reta gerizon. Enkyetid sou sitotoksisite an ajan vitro yo te rapòte ak plizyè pansman an ajan10,11. Sepandan, nan sitotoksisite vitro pa gen ankò tradui nan toksisite nan vivo, ak plizyè Ag1+ pansman te demontre yon pwofil sekirite bon12.
Isit la, nou envestige efikasite nan karboksimetilcellulose pansman ki gen roman formulations ajan kont biofilm blesi nan vitro ak nan vivo. Anplis de sa, efè sa yo pansman sou repons iminitè ak gerizon endepandan de enfeksyon yo te evalye.
Tout pansman yo itilize yo te komèsyalman disponib. 3M Kerracel jèl fib abiye (3m, Knutsford, UK) se yon ki pa antimikrobyen 100% carboxymethylcellulose (CMC) jèl fib abiye ki te itilize kòm abiye an kontwòl nan etid sa a. Twa pansman antibiotics CMC ajan yo te evalye, sètadi 3M Kerracel AG abiye (3m, Knutsford, UK), ki gen 1.7%wt. Oksijene sèl ajan (Ag7NO11) nan pi wo iyon ajan valans (Ag1+, Ag2+ak Ag3+). Pandan dekonpozisyon nan Ag7No11, Ag1+, Ag2+ ak Ag3+ iyon yo te fòme nan yon rapò nan 1: 2: 4. Aquacel AG Siplemantè abiye ki gen 1.2% klori an ajan (Ag1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 ak Aquacel AG+abiye siplemantè ki gen 1.2% klori an ajan (Ag1+), EDTA ak klori benzetonyòm (Convatec, Deeside, UK) 14.
Tansyon yo itilize nan etid sa a yo te Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Piblik Sante Angletè, Salisbury) ak Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Piblik Sante England, Salisbury).
Bakteri yo te grandi lannwit lan nan bouyon Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, UK). Kilti a lannwit lan te Lè sa a, dilye 1: 100 nan bouyon Mueller-Hinton ak 200 µl plake sou esteril 0.2 µm Whatman manbràn cyclopore (Whatman Plc, Maidstone, UK) sou Mueller-Hinton Agar Plak (Sigma-Aldrich Konpayi Ltd, Kent, Grann Britanik ). ) Fòmasyon biofilm kolonyal nan 37 ° C pou 24 èdtan. Sa yo biofilm kolonyal yo te teste pou kontraksyon logaritmik.
Koupe abiye an nan 3 cm2 moso kare ak pre-Moisten ak dlo esteril deionized. Mete bandaj la sou biofilm nan koloni an sou plak la agar. Chak 24 ha nan biofilm te retire, ak bakteri solid nan biofilm a (CFU/mL) yo te chiffres pa dilution seri (10−1 a 10−7) nan jou-ang bouyon netralize (Merck-Millipore). Apre 24 èdtan nan enkubasyon nan 37 ° C, konte plak estanda yo te fè sou plak agar Mueller-Hinton. Chak tretman ak pwen tan te fèt nan triplicate, ak konte plak yo te repete pou chak dilution.
Se po vant vyann kochon jwenn nan fi gwo kochon blan nan 15 minit nan masak an akò ak estanda ekspòtasyon Inyon Ewopeyen an. Te po a kale ak netwaye ak ti sèvyèt mouye pou alkòl, Lè sa a, jele nan -80 ° C pou 24 èdtan devitalize po la. Apre deglase, 1 cm2 moso po yo te lave twa fwa ak PBS, 0.6% ipoklorit sodyòm, ak 70% etanòl pou 20 minit chak fwa. Anvan yo retire epidèm lan, retire nenpòt ki etanòl ki rete nan lave 3 fwa nan PBS esteril. Po a te kiltive nan yon plak 6-byen ak yon manbràn nilon 0.45-μm-epè (Merck-Millipore) sou tèt ak 3 kousinen dezenfekte (Merck-Millipore) ki gen 3 ml serom bovin (Sigma) complétée ak 10% Dulbecco a modifye modifye Eagle. Mwayen (Dulbecco a modifye Eagle Mwayen - Aldrich Ltd).
Biofilm kolonyal yo te grandi jan sa dekri pou etid ekspozisyon biofilm. Apre kilti biofilm a sou manbràn lan pou 72 èdtan, yo te biofilm a aplike nan sifas la po lè l sèvi avèk yon bouk inokulasyon esteril ak manbràn lan te retire li. Biofilm a te Lè sa a, enkubasyon sou dèrm kochon an pou yon lòt 24 èdtan nan 37 ° C yo ki pèmèt biofilm a matirite ak konfòme yo ak po kochon an. Apre yo te biofilm a gen ase matirite ak tache, yon 1.5 cm2 abiye, pre-mouye ak dlo esteril distile, yo te aplike dirèkteman nan sifas la po ak enkubasyon nan 37 ° C pou 24 èdtan. Bakteri solid yo te vizualiz pa tach pa egzakteman menm jan aplike Prestoblue selil viabilité reyaktif (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) nan sifas la apèks nan chak explant ak enkubasyon li pou 5 minit. Sèvi ak Leica DFC425 kamera dijital la imedyatman pran imaj sou mikwoskòp la Leica MZ8. Zòn ki gen koulè woz yo te chiffre lè l sèvi avèk Imaj Pro Software Version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). Yo te fè mikroskopi elektwonik yo jan sa dekri anba a.
Bakteri grandi lannwit lan te dilye 1: 100 nan bouyon Mueller-Hinton. 200 μl nan kilti te ajoute nan esteril 0.2 μm Whatman Cyclopore manbràn (Whatman, Maidstone, UK) ak plake sou Agar Mueller-Hinton. Plak biofilm yo te enkubasyon nan 37 ° C pou 72 èdtan yo ki pèmèt fòmasyon biofilm ki gen matirite.
Apre 3 jou nan spirasyon biofilm, yo te mete yon bandaj kare 3 cm2 dirèkteman sou biofilm a ak enkubasyon nan 37 ° C pou 24 èdtan. Apre retire bandaj la nan sifas la biofilm, 1 ml nan reyaktif prestoblue viabilite selil (Invitrogen, Waltham, MA) te ajoute nan sifas la nan chak biofilm pou 20 segonn. Sifas yo te seche anvan chanjman koulè yo te anrejistre lè l sèvi avèk yon kamera dijital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd, Kingston, UK).
Prepare kilti lannwit lan sou agar Mueller-Hinton, transfere koloni endividyèl a 10 ml Mueller-Hinton bouyon ak enkubate sou yon Shaker nan 37 ° C (100 rpm). Apre enkubasyon lannwit lan, yo te kilti a dilye 1: 100 nan bouyon Mueller-Hinton ak 300 µl te lokalize sou 0.2 µm sikilè whatman manbràn cyclopore (Whatman Entènasyonal, Maidstone, UK) sou Mueller-Hinton agar ak enkubasyon nan 37 ° C nan 72 èdtan . . Biofilm ki gen matirite a te aplike nan blesi a jan sa dekri anba a.
Tout travay ak bèt yo te te pote soti nan Inivèsite a nan Manchester anba yon lisans pwojè ki te apwouve pa Biwo pou byennèt Animal ak Revizyon etik (P8721BD27) ak an akò ak direktiv ki te pibliye pa Biwo Kay la anba 2012 ASPA a revize. Tout otè respekte direktiv yo rive. Uit-semèn-fin vye granmoun C57BL/6J sourit (Envigo, Oxon, UK) yo te itilize pou tout etid nan vivo. Sourit yo te anestezi ak isoflurane (Piramal Swen kritik Ltd, West Drayton, UK) ak sifas dorsal yo te kale ak netwaye. Chak sourit te Lè sa a, bay yon 2 × 6 mm excisional blesi lè l sèvi avèk yon Stiefel byopsi kout pyen (Schuco Entènasyonal, Hertfordshire, UK). Pou blesi biofilm ki enfekte, aplike 72 èdtan biofilm kolonyal grandi sou manbràn lan jan sa dekri anwo a nan kouch nan po nan blesi a lè l sèvi avèk yon bouk inokulasyon esteril imedyatman apre aksidan ak jete manbràn lan. Yon santimèt kare nan abiye se pre-mouye ak dlo esteril yo kenbe yon anviwònman blesi imid. Pansman yo te aplike dirèkteman nan chak blesi ak kouvri ak 3m fim tegaderm (3M, Bracknell, UK) ak mastisol likid adezif (Eloquest Swen Sante, Ferndale, MI) aplike alantou bor yo bay adezyon adisyonèl. Buprenorphine (Animalcare, York, UK) te administre nan yon konsantrasyon nan 0.1 mg/kg kòm yon analgesic. Sourit Cull twa jou apre aksidan lè l sèvi avèk metòd la 1 metòd ak retire, halve, ak magazen zòn nan blesi jan sa nesesè.
Hematoxylin (Thermofisher syantifik) ak eozin (Thermofisher syantifik) tach te fèt dapre pwotokòl manifakti a. Zòn blesi ak reepithelialization yo te chiffres lè l sèvi avèk Imaj Pro Software Version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Seksyon tisi yo te dewaxed nan ksilèn (Thermofisher syantifik, Loughborough, UK), reidrat ak 100-50% etanòl kalifye, ak yon ti tan benyen nan dlo deionized (Thermofisher syantifik). Imunohistochimik te fèt lè l sèvi avèk Vectastain elit ABC PK-6104 twous lan (Laboratwa vektè, Burlingame, CA) dapre pwotokòl fabrikan an. Antikò primè nan netwofil NIMP-R14 (Thermofisher syantifik) ak macrophages MS CD107B pi M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) yo te dilye 1: 100 nan solisyon bloke ak ajoute nan sifas la koupe, ki te swiv pa 2 antikò anti-, vectastain ABC ak vektè Nova Wouj peroksidaz (HRP) twous substrate (Laboratwa vektè, Burlingame, CA) ak counterstained ak ematoksilin. Imaj yo te akeri lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Olympus BX43 ak yon kamera dijital Olympus DP73 (Olympus, Southend-sou-lanmè, UK).
Echantiyon po yo te fiks nan 2.5% glutaraldehyde ak 4% fòmaldeyid nan 0.1 M HEPES (pH 7.4) pou 24 èdtan nan 4 ° C. Echantiyon yo te dezidrate lè l sèvi avèk etanòl korije ak seche nan CO2 lè l sèvi avèk yon kowòm K850 seche rad pwen kritik (kowòm teknoloji Ltd, Loughton, UK) ak sputter kouvwi ak alyaj lò-paladyòm lè l sèvi avèk yon kowòm SC7620 mini sputterer/sistèm egzeyat ekla. Echantiyon yo te imaje lè l sèvi avèk yon FEI Quanta 250 optik mikwoskòp elèktron (Thermofisher syantifik) visualized pwen santral la nan blesi a.
Toto-1 yodid (2 μm) te aplike nan sifas la blesi sourit excised ak enkubasyon pou 5 min nan 37 ° C (Thermofisher syantifik) ak trete ak Syto-60 (10 μm) nan 37 ° C (Thermofisher syantifik). 15-minit Z-chemine imaj yo te kreye lè l sèvi avèk yon Leica TCS SP8.
Byolojik ak teknik done replike yo te tabulated ak analize lè l sèvi avèk GraphPad Prism V9 lojisyèl (GraphPad Software, La Jolla, CA). Yon sèl-fason analiz de divèjans ak konparezon miltip lè l sèvi avèk Post Dunnett a tès sa a te itilize yo teste pou diferans ki genyen ant chak tretman ak abiye an ki pa antimikrobyen kontwòl. Yon valè P <0.05 te konsidere siyifikatif.
Efikasite nan pansman ajan jèl fib te premye evalye kont koloni biofilm nan Staphylococcus aureus ak Pseudomonas aeruginosa nan vitro. Pansman an ajan gen fòmil diferan an ajan: pansman an ajan tradisyonèl pwodwi Ag1+ iyon; Pansman an ajan, ki ka pwodwi Ag1+ iyon apre adisyon nan EDTA/BC, ka detwi matris la biofilm ak ekspoze bakteri an ajan anba efè a anti -bakteri nan ajan. Ions15 ak pansman ki gen oksijene sèl Ag ki pwodui Ag1+, Ag2+ ak Ag3+ iyon. Efikasite li te konpare ak yon pansman kontwòl ki pa antimikrobyen te fè soti nan fib jele. Rete bakteri solid nan biofilm a te evalye chak 24 èdtan pou 8 jou (Figi 1). Nan jou 5, yo te biofilm a reinoculate ak 3.85 × 105s. Staphylococcus aureus oswa 1.22 × 105p. Aeruginosa pou evalye rekiperasyon biofilm. Konpare ak pansman kontwòl ki pa antimikrobyen, Ag1+ pansman te gen efè minim sou viabilite bakteri nan Staphylococcus aureus ak Pseudomonas aeruginosa biofilms sou 5 jou. Nan contrast, pansman ki gen oksijene AG ak Ag1 + + EDTA/BC sèl yo te efikas nan touye bakteri nan biofilm a nan 5 jou. Apre repete inokulasyon ak bakteri planktonik nan jou 5, pa gen okenn restorasyon nan biofilm a obsève (Fig. 1).
Kwantifikasyon nan bakteri solid nan Staphylococcus aureus ak Pseudomonas aeruginosa biofilms apre tretman ak pansman an ajan. Koloni biofilm nan Staphylococcus aureus ak Pseudomonas aeruginosa yo te trete ak pansman an ajan oswa pansman ki pa antimikrobyen kontwòl, ak nimewo a nan bakteri solid ki rete yo te detèmine chak 24 èdtan. Apre 5 jou, yo te biofilm a reinoculate ak 3.85 × 105s. Staphylococcus aureus oswa 1.22 × 105p. Koloni nan bakterioplankton Pseudomonas aeruginosa yo te fòme endividyèlman pou evalye rekiperasyon biofilm. Graf montre vle di +/- estanda erè.
Vizyalize efè a nan pansman an ajan sou viabilité biofilm, pansman yo te aplike nan biofilms ki gen matirite grandi sou pork po ex vivo. Apre 24 èdtan, se abiye an retire ak biofilm a se tache ak yon lank ble reyaktif, ki se metabolize pa bakteri k ap viv nan yon koulè woz. Biofilm trete ak pansman kontwòl yo te woz, ki endike prezans nan bakteri solid nan biofilm a (Figi 2A). Nan contrast, biofilm a trete ak Ag oxysols abiye yo te prensipalman ble, ki endike ke bakteri ki rete yo sou sifas la nan po kochon an te bakteri ki pa viyab (Figi 2b). Te kolorasyon melanje ble ak woz obsève nan biofilms trete ak Ag1+ ki gen pansman, ki endike prezans nan bakteri solid ak ki pa solid nan biofilm a (Figi 2C), tandiske EDTA/BC pansman ki gen AG1+ yo te majorite ble ak kèk tach woz. ki endike zòn ki pa afekte pa abiye an ajan (Figi 2D). Kwantifikasyon nan aktif (woz) ak inaktif (ble) zòn te montre ke patch la kontwòl te 75% aktif (Figi 2E). Ag1 + + EDTA/BC pansman fè menm jan ak oksijene Ag pansman sèl, ak to siviv nan 13% ak 14%, respektivman. Ag1+ abiye an tou redwi viabilite bakteri pa 21%. Sa yo biofilms te Lè sa a, obsève lè l sèvi avèk optik mikroskopi elèktron (SEM). Apre tretman ak abiye an kontwòl ak AG1+ abiye an, yo te yon kouch nan Pseudomonas aeruginosa obsève ki kouvri po a porch (Figi 2F, H), tandiske apre tretman ak AG1+ abiye an, kèk selil bakteri yo te jwenn ak kèk selil bakteri yo te jwenn anba. Fib kolagen an ka konsidere kòm estrikti nan tisi nan po pork (Figi 2G). Apre tretman ak Ag1 + + EDTA/BC abiye, plakèt bakteri ak kache plakèt fib kolagen an te vizib (Figi 2i).
Vizyalizasyon nan biofilm Pseudomonas aeruginosa apre tretman an ajan abiye. (A-D) viabilité bakteri nan Pseudomonas aeruginosa biofilms grandi sou po pork te vizualiz lè l sèvi avèk prestoblue viabilite lank 24 èdtan apre tretman ak pansman an ajan oswa pansman ki pa antimikrobyen kontwòl. Bakteri viv yo woz, bakteri ki pa solid ak po kochon yo ble. (E) quantification nan Pseudomonas aeruginosa biofilms grandi sou po pork (woz plas) lè l sèvi avèk optik mikroskopi elektwonik imaj Pro vèsyon 10 (FI) ak trete ak yon abiye an ajan oswa yon ki pa antimikrobyen kontwòl abiye pou 24 èdtan. SEM echèl ba = 5 µm. (J - M) Biofilm kolonyal te grandi sou filtè epi yo te tache ak prestoblue lank reyaktif apre 24 h nan enkubasyon ak pansman an ajan.
Pou detèmine si kontak sere ant pansman yo ak biofilms yo afekte efikasite nan pansman yo, biofilm kolonyal yo mete sou yon sifas ki plat yo te trete ak pansman yo pou 24 èdtan ak Lè sa a, tache ak koloran reyaktif. Biofilm ki pa trete a te fè nwa woz nan koulè (Figi 2J). Kontrèman a biofilms trete ak pansman ki gen oksijene sèl Ag (Figi 2K), biofilms trete ak pansman ki gen Ag1+ oswa Ag1++ EDTA/BC te montre Gwoup Mizik nan tach woz (Figi 2L, M). Sa a kolorasyon woz endike prezans nan bakteri solid ak ki asosye ak zòn nan suture nan abiye an. Zòn sa yo koud-nan kreye espas ki mouri ki pèmèt bakteri nan biofilm a yo siviv.
Pou evalye efikasite nan pansman an ajan nan vivo, plen epesè excised blesi nan sourit ki enfekte ak ki gen matirite S. aureus ak P. aeruginosa biofilms yo te trete ak pansman kontwòl nonantimicrobial oswa pansman an ajan. Apre 3 jou nan tretman, analiz imaj makroskopik te montre pi piti gwosè blesi lè trete ak pansman oksijene sèl konpare ak pansman ki pa antimikrobyen kontwòl ak lòt pansman an ajan (Figi 3A-H). Pou konfime obsèvasyon sa yo, blesi yo te rekolt ak zòn blesi ak reepithelialization yo te chiffres sou ematoksilin ak eosin-tache seksyon tisi lè l sèvi avèk Imaj Pro Software Version 10 (Figi 3i-L).
Efè a nan pansman an ajan sou sifas la blesi ak re-epitelyalizasyon nan blesi ki enfekte ak biofilms. (A - H) ti selil ki enfekte ak biofilms nan Pseudomonas aeruginosa (A - D) ak Staphylococcus aureus (E -H) apre twa jou nan tretman ak yon pansman kontwòl nonantimicrobyen, yon oksijene Ag abiye sèl, yon Ag1+ abiye, ak yon Ag1++ abiye. Reprezantan imaj makroskopik. Blesi nan sourit ak Ag1 + + EDTA/BC abiye. (IL) Reprezantan Pseudomonas aeruginosa enfeksyon, seksyon istolojik tache ak ematoksilin ak eozin, yo itilize pou quantifier zòn blesi ak rejenerasyon epitelyal. Kwantifikasyon nan zòn blesi (M, O) ak pousantaj reepithelialization (N, P) nan blesi ki enfekte ak Pseudomonas aeruginosa (M, N) ak Staphylococcus aureus (O, P) biofilms (pou chak gwoup tretman N = 12). Graf montre vle di +/- estanda erè. * vle di p = <0.05 ** vle di p = <0.01; Echèl makroskopik = 2.5 mm, echèl istolojik = 500 µm.
Kwantifikasyon nan zòn blesi nan blesi ki enfekte ak Pseudomonas aeruginosa biofilm (Figi 3M) te montre ke blesi trete ak Ag oxysalts te gen yon gwosè blesi mwayèn nan 2.5 mm2, pandan y ap ki pa antimikrobyen abiye kontwòl te gen yon gwosè blesi mwayèn nan 3.1 mm2, ki se pa vre. rive nan estatistik siyifikasyon (Figi 3M). p = 0.423). Blesi trete ak Ag1+ oswa Ag1++ EDTA/BC te montre pa gen okenn rediksyon nan zòn blesi (3.1 mm2 ak 3.6 mm2, respektivman). Tretman ak oksijene Ag sèl abiye ankouraje re-epitelyalizasyon nan yon limit pi plis pase abiye an ki pa antimikrobyen kontwòl (34% ak 15%, respektivman; p = 0.029) ak Ag1+ oswa Ag1++ EDTA/BC (10% ak 11%) ( Figi 3n). . , respektivman).
Tandans ki sanble nan zòn blesi ak rejenerasyon epitelyal yo te obsève nan blesi ki enfekte ak S. aureus biofilms (Figi 3O). Pansman ki gen sèl oksijene ajan redwi zòn blesi (2.0 mm2) pa 23% konpare ak kontwòl la ki pa antimikrobyen abiye (2.6 mm2), byenke rediksyon sa a pa t 'enpòtan (P = 0.304) (Fig. 3O). Anplis de sa, zòn nan blesi nan gwoup la tretman AG1+ te yon ti kras redwi (2.4 mm2), pandan y ap blesi a trete ak Ag1++ EDTA/BC abiye pa t 'diminye zòn nan blesi (2.9 mm2). Sèl oksijèn nan Ag tou ankouraje re-epitelyalizasyon nan blesi ki enfekte ak S. aureus biofilm (31%) nan yon limit pi plis pase sa yo trete ak pansman ki pa antimikrobyen kontwòl (12%, p = 0.003) (Figi 3p). Ag1+ abiye (16%, p = 0.903) ak Ag+ 1+ EDTA/BC abiye (14%, p = 0.965) te montre nivo nan rejenerasyon epitelyal menm jan ak kontwòl.
Vizyalize efè a nan pansman an ajan sou matris la biofilm, Toto 1 ak Syto 60 yodid tach te fèt (Fig. 4). TOTO 1 yodid se yon lank selil-enpermabl ki ka itilize avèk presizyon visualized eksetera asid nikleyik yo, ki se abondan nan EPS yo nan biofilms. Syto 60 se yon selil pèmeyab lank yo itilize kòm yon counterstain16. Obsèvasyon nan Toto 1 ak Syto 60 yodid nan blesi inokule ak biofilms nan Pseudomonas aeruginosa (Figi 4a-D) ak Staphylococcus aureus (Figi 4i-L) te montre ke apre 3 jou nan tretman abiye, EPS nan biofilm a te siyifikativman redwi. ki gen sèl oksijene Ag ak Ag1 + + EDTA/BC. Ag1+ pansman san yo pa eleman adisyonèl antibiofilm siyifikativman redwi selil-gratis ADN nan blesi inokule ak Pseudomonas aeruginosa men yo te mwens efikas nan blesi inokule ak Staphylococcus aureus.
Nan vivo D 'nan biofilm blesi apre 3 jou nan tretman ak kontwòl oswa ajan pansman. Imaj konfok nan Pseudomonas aeruginosa (A - D) ak Staphylococcus aureus (I -L) tache ak toto 1 (vèt) visualized eksetera asid nikleyik, yon eleman nan polimè biofilm eksetera. Pou tach asid nikleyik entranglè, sèvi ak Syto 60 (wouj). asid. P. analysis mikroskopi elektwonik nan blesi ki enfekte ak Pseudomonas aeruginosa (E -H) ak Staphylococcus aureus (M -P) biofilms apre 3 jou nan tretman ak kontwòl ak ajan pansman. SEM echèl ba = 5 µm. Konfokal echèl D 'ba = 50 µm.
Mikwoskopi elektwonik analysis te montre ke sourit inokule ak koloni biofilm nan Pseudomonas aeruginosa (Figi 4E-H) ak Staphylococcus aureus (Figi 4M-P) te gen siyifikativman mwens bakteri nan blesi yo apre 3 jou nan tretman ak tout pansman an ajan.
Pou evalye efè pansman an ajan sou enflamasyon blesi nan sourit biofilm ki enfekte, seksyon nan blesi biofilm ki enfekte trete ak kontwòl oswa pansman an ajan pou 3 jou yo te immunohistochemically tache lè l sèvi avèk antikò espesifik pou neutrofil ak macrophages. Detèminasyon quantitative nan netwofil ak macrophages intern. tisi granulasyon. Figi 5). Tout pansman an ajan redwi kantite neutrofil ak macrophages nan blesi ki enfekte ak Pseudomonas aeruginosa konpare ak pansman ki pa antimikrobyen kontwòl apre twa jou nan tretman an. Sepandan, tretman ak ajan an oksijene abiye sèl lakòz yon rediksyon pi gwo nan netwofil (p = <0.0001) ak macrophages (p = <0.0001) konpare ak lòt pansman an ajan teste (Figi 5i, j). Malgre ke AG1++ EDTA/BC te gen yon pi gwo efè sou biofilm blesi, li redwi neutrofil ak nivo macrofaj nan yon limit pi piti pase AG1+ abiye an. Blesi modere ki enfekte ak S. aureus biofilm yo te tou obsève apre abiye ak Ag (P = <0.0001), Ag1+ (P = 0.0008) ak Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0.0043) oxisols konpare ak kontwòl. Tandans ki sanble yo obsève pou neutropenia. bandaj (Fig. 5K). Sepandan, sèlman oksijene Ag abiye an sèl te montre yon rediksyon enpòtan nan kantite macrophages nan tisi granulation konpare ak kontwòl nan blesi ki enfekte ak S. aureus biofilms (p = 0.0339) (Figi 5L).
Netwofil ak macrophages yo te chiffre nan blesi ki enfekte ak Pseudomonas aeruginosa ak Staphylococcus aureus biofilms apre 3 jou nan tretman ak ki pa antimikrobyen oswa pansman an ajan. Netwofil (AD) ak macrophages (EH) yo te chiffres nan seksyon tisi tache ak antikò espesifik pou netwofil oswa macrophages. Kwantifikasyon nan neutrofil (I ak K) ak macrophages (J ak L) nan blesi ki enfekte ak Pseudomonas aeruginosa (I ak J) ak Staphylococcus aureus (K & L) biofilms. N = 12 pou chak gwoup. Graf yo montre vle di +/- erè estanda, valè siyifikasyon konpare ak ki pa antibacterial kontwòl abiye, * vle di p = <0.05, ** vle di p = <0.01; *** vle di p = <0.001; endike p = <0.0001).
Nou Lè sa a, evalye efè a nan pansman an ajan sou enfeksyon-endepandan gerizon. Ki pa enfekte blesi excisional yo te trete ak yon pansman ki pa antimikrobyen kontwòl oswa yon abiye an ajan pou 3 jou (Figi 6). Pami pansman an ajan yo teste, sèlman blesi trete ak abiye an oksijene sèl parèt pi piti sou imaj makroskopik pase blesi trete ak kontwòl la (Figi 6A-D). Kwantifikasyon nan zòn blesi lè l sèvi avèk analiz istolojik te montre ke zòn nan blesi mwayèn apre tretman ak Ag oxysols abiye yo te 2.35 mm2 konpare ak 2.96 mm2 pou blesi trete ak gwoup la kontwòl, men diferans sa a pa t 'rive nan siyifikasyon estatistik (p = 0.488) (fig frans . Nan contrast, pa gen okenn rediksyon nan zòn blesi obsève apre tretman ak Ag1+ (3.38 mm2, p = 0.757) oswa Ag1++ EDTA/BC (4.18 mm2, p = 0.054) pansman konpare ak gwoup la kontwòl. Te ogmante rejenerasyon epitelyal obsève ak Ag oxysol abiye an konpare ak gwoup la kontwòl (30% vs 22%, respektivman), byenke sa a pa t 'rive jwenn siyifikasyon (p = 0.067), sa a se byen enpòtan ak konfime rezilta anvan yo. Yon abiye ak oxysols fè pwomosyon re-epitelyalizasyon. -Epitelizasyon nan blesi ki pa enfekte17. Nan contrast, tretman ak Ag1+ oswa Ag1++ EDTA/BC pansman pa te gen okenn efè oswa te montre diminye re-epitelyalizasyon konpare ak kontwòl.
Efè an ajan abiye blesi sou gerizon blesi nan sourit ki pa enfekte ak rezeksyon konplè. (AD) Reprezantan imaj makroskopik nan blesi apre twa jou nan tretman ak yon abiye ki pa antimikrobyen kontwòl ak yon abiye an ajan. (Eh) Reprezantan seksyon blesi tache ak ematoksilin ak eozin. Kwantifikasyon nan zòn blesi (mwen) ak pousantaj nan reepithelialization (J) yo te kalkile soti nan seksyon istolojik nan pwen milye a nan blesi a lè l sèvi avèk lojisyèl analiz imaj (n = 11-12 pou chak gwoup tretman). Graf montre vle di +/- estanda erè. * vle di p = <0.05.
Silver gen yon istwa long nan itilize kòm yon terapi antibiotics nan gerizon blesi, men anpil formulasyon yo diferan ak metòd livrezon ka rezilta nan diferans ki genyen nan efikasite antibiotics 18. Anplis, pwopriyete yo antibiofilm nan sistèm livrezon ajan espesifik yo pa konplètman konprann. Malgre ke repons iminitè lame a se relativman efikas kont bakteri planktonik, li se jeneralman mwens efikas kont biofilms19. Planktonik bakteri yo fasilman fagosit pa macrophages, men nan biofilms, selil agrégées poze pwoblèm adisyonèl pa limite repons lan lame nan limit ki selil iminitè ka sibi apoptoz ak lage faktè proinflammatory amelyore repons iminitè a20. Li te obsève ke kèk lekosit ka antre nan biofilms21 men yo kapab bakteri fagosit yon fwa defans sa a se konpwomèt22. Yo ta dwe itilize yon apwòch holistic pou sipòte repons iminitè lame a kont enfeksyon biofilm blesi. Debridement blesi ka fizikman deranje biofilm a epi retire pi fò nan bioburden a, men repons iminitè lame a ka efikas kont biofilm ki rete yo, espesyalman si repons iminitè lame a konpwomèt. Se konsa, terapi antibiotics tankou pansman an ajan ka sipòte lame a repons iminitè ak elimine enfeksyon biofilm. Konpozisyon, konsantrasyon, solubility, ak substrate livrezon ka enfliyanse efikasite nan antibiotics nan ajan. Nan dènye ane yo, pwogrè nan teknoloji pwosesis an ajan te fè pansman sa yo pi efikas9,23. Kòm ajan abiye teknoloji avans, li enpòtan yo konprann efikasite nan sa yo pansman nan kontwole enfeksyon blesi ak, pi enpòtan, enpak la nan fòm sa yo ki pisan an ajan sou anviwònman an blesi ak gerizon.
Nan etid sa a, nou konpare efikasite nan de pansman an ajan avanse ak pansman an ajan konvansyonèl ki pwodwi AG1+ iyon kont biofilms lè l sèvi avèk diferan nan vitro ak nan modèl vivo. Nou menm tou nou evalye efè sa yo pansman sou anviwònman an blesi ak enfeksyon-endepandan gerizon. Pou minimize enfliyans nan matris la livrezon, tout pansman an ajan teste yo te konpoze de karboksimetilcellulose.
Evalyasyon preliminè nou an nan sa yo pansman an ajan kont biofilm kolonyal nan Pseudomonas aeruginosa ak Staphylococcus aureus montre ke, kontrèman ak tradisyonèl Ag1+ pansman, de pansman an ajan avanse, Ag1++ EDTA/BC ak oksijene Ag sèl, yo efikas nan 5. kèk jou. Anplis de sa, sa yo pansman anpeche re-fòmasyon nan biofilm sou repete ekspoze a bakteri planktonik. Ag1+ abiye an ki gen klori an ajan, menm konpoze an ajan ak matris baz kòm AG1++ EDTA/BC, ak te gen yon efè limite sou viabilité bakteri nan biofilm a sou menm peryòd la. Obsèvasyon an ke yon Ag1++ EDTA/BC abiye te pi efikas kont biofilm pase yon Ag1+ abiye ki gen menm matris la ak yon konpoze an ajan sipòte nosyon an ki engredyan adisyonèl yo oblije ogmante efikasite nan klori an ajan kont biofilm, jan yo te rapòte yo. Yon lòt kote15. Rezilta sa yo sipòte lide ke BC ak EDTA jwe yon wòl adisyonèl ki kontribiye nan efikasite abiye an jeneral e ke absans eleman sa a nan Ag1+ pansman te kontribye nan echèk la pou demontre efikasite nan vitro. Nou te jwenn ke oksijene Ag pansman sèl pwodwi Ag2+ ak Ag3+ iyon ekspoze pi fò efikasite anti -bakteri pase Ag1+ ak nan nivo ki sanble ak Ag1++ EDTA/BC. Sepandan, akòz potansyèl la redox segondè, li se klè konbyen tan Ag3+ iyon rete aktif ak efikas kont biofilm blesi ak Se poutèt sa merite plis etid. Anplis de sa, gen anpil pansman diferan ki jenere AG1+ iyon ki pa te teste nan etid sa a. Sa yo pansman yo konpoze de diferan konpoze an ajan, konsantrasyon, ak matris baz, ki ka enfliyanse livrezon an nan Ag1+ iyon ak efikasite yo kont biofilms. Li se tou vo anyen ki gen anpil diferan nan vitro ak nan modèl vivo itilize evalye efikasite nan pansman blesi kont biofilms. Kalite modèl yo itilize, osi byen ke kontni sèl ak pwoteyin nan medya yo itilize nan modèl sa yo, pral enfliyanse efikasite nan abiye an. Nan modèl nan vivo nou an, nou pèmèt biofilm a matirite nan vitro ak Lè sa a, transfere li nan sifas la po nan blesi a. Repons iminitè sourit lame a se relativman efikas kont bakteri planktonik aplike nan blesi a, kidonk fòme yon biofilm kòm blesi a geri. Adisyon nan biofilm ki gen matirite nan yon blesi limite efikasite nan repons lan lame iminitè a fòmasyon biofilm pa pèmèt biofilm a ki gen matirite etabli tèt li nan blesi a anvan geri ka kòmanse. Se konsa, modèl nou an pèmèt nou evalye efikasite nan pansman antibiotics sou biofilms ki gen matirite anvan blesi kòmanse geri.
Nou menm tou nou te jwenn ke abiye anfòm enfliyanse efikasite nan pansman an ajan sou nan vitro-grandi biofilms ak po pork. Se sere kontak ak blesi a konsidere kòm kritik pou efikasite nan antibiotics nan abiye24,25 la. Pansman ki gen oksijene sèl AG yo te nan kontak sere avèk biofilms ki gen matirite, sa ki lakòz yon rediksyon enpòtan nan kantite bakteri solid nan biofilm a apre 24 èdtan. Nan contrast, lè trete ak Ag1+ ak Ag1++ EDTA/BC pansman, nimewo siyifikatif nan bakteri solid rete. Sa yo pansman gen ladan sutur ansanm longè a tout antye de abiye an, ki kreye espas mouri ki anpeche kontak sere avèk biofilm la. Nan etid in vitro nou yo, zòn sa yo ki pa kontakte anpeche touye nan bakteri solid nan biofilm la. Nou evalye viabilite bakteri sèlman apre 24 èdtan nan tretman; Apre yon tan, kòm abiye an vin pi satire, ka gen mwens espas mouri, diminye zòn nan pou sa yo bakteri solid. Sepandan, sa a mete aksan sou enpòtans ki genyen nan konpozisyon an nan abiye an, pa sèlman ki kalite ajan nan abiye an.
Pandan ke etid in vitro yo itil pou konpare efikasite nan diferan teknoloji an ajan, li enpòtan tou pou konprann efè sa yo pansman sou biofilms nan vivo, kote tisi lame ak repons iminitè kontribye nan efikasite nan pansman yo kont biofilms. Te efè a nan pansman sa yo sou biofilm blesi obsève lè l sèvi avèk optik mikroskopi elektwonik ak EPS tach nan biofilm a lè l sèvi avèk entrakelilè ak eksetera ADN koloran. Nou te jwenn ke apre 3 jou nan tretman, tout pansman yo te efikas nan diminye ADN selil-gratis nan blesi biofilm ki enfekte, men AG1+ abiye yo te mwens efikas nan Staphylococcus aureus ki enfekte blesi. Analiz mikroskopi elèktron te montre tou ke siyifikativman mwens bakteri yo te prezan nan blesi trete ak pansman an ajan, byenke sa a te pi pwononse ak oksijene Ag abiye an sèl ak Ag1++ EDTA/BC abiye an konpare ak Ag1+ abiye an. Done sa yo montre ke pansman an ajan teste te gen degre yo varye enpak sou estrikti biofilm, men okenn nan pansman yo an ajan yo te kapab detwi biofilm a, sipòte bezwen an pou yon apwòch holistic nan tretman an nan enfeksyon biofilm blesi; Sèvi ak braslè an ajan. Tretman an anvan pa debridement fizik yo retire pi fò nan biofilm la.
Blesi kwonik yo souvan nan yon eta de enflamasyon grav, ak depase selil enflamatwa ki rete nan tisi a blesi pou yon peryòd pwolonje nan tan, sa ki lakòz domaj tisi ak apovri oksijèn ki nesesè pou efikas metabolis selilè ak fonksyon nan blesi a26. Biofilms agrave anviwònman blesi ostil sa a pa afekte gerizon nan yon varyete fason, ki gen ladan anpèchman nan pwopagasyon selil ak migrasyon ak deklanchman nan sitokin proinflammatory27. Kòm pansman an ajan vin pi efikas, li enpòtan yo konprann enpak la yo gen sou anviwònman an blesi ak gerizon.
Enteresan, byenke tout pansman an ajan ki afekte konpozisyon biofilm, sèlman oksijene pansman sèl ajan ogmante re-epithelialization nan blesi sa yo ki enfekte. Done sa yo sipòte rezilta anvan nou yo17 ak sa yo ki nan Kalan et al. (2017) 28, ki demontre bon sekirite ak toksisite Des nan oksijene sèl ajan, kòm pi ba konsantrasyon an ajan yo te efikas kont biofilms.
Etid aktyèl nou an mete aksan sou diferans ki genyen nan teknoloji an ajan ant pansman antibiotics an ajan ak enpak la nan teknoloji sa a sou anviwònman an blesi ak enfeksyon-endepandan gerizon. Sepandan, rezilta sa yo diferan de etid anvan ki montre ke AG1 + + EDTA/BC abiye amelyore paramèt gerizon nan zòrèy lapen blese nan vivo. Sepandan, sa a ka rive akòz diferans ki genyen nan modèl bèt, fwa mezi, ak metòd aplikasyon bakteri29. Nan ka sa a, mezi blesi yo te pran 12 jou apre aksidan yo ki pèmèt engredyan yo aktif nan abiye an yo aji sou biofilm a sou yon peryòd tan ki pi long. Sa a se sipòte pa yon etid ki te montre ke klinikman enfekte ilsè janm trete ak AG1 + + EDTA/BC okòmansman ogmante nan gwosè apre yon semèn nan tretman, ak Lè sa a, sou pwochen 3 semèn yo nan tretman ak AG1 + + EDTA/BC ak nan 4 semèn nan Sèvi ak ki pa antimicrobians. dwòg. CMC pansman diminye gwosè a nan ilsè30.
Sèten fòm ak konsantrasyon an ajan te deja yo te montre yo dwe sitotoksik nan vitro 11, men sa yo nan rezilta vitro pa toujou tradwi nan efè negatif nan vivo. Anplis de sa, pwogrè nan teknoloji an ajan ak yon pi bon konpreyansyon yo genyen sou konpoze an ajan ak konsantrasyon nan pansman yo te mennen nan devlopman nan anpil pansman an ajan san danje epi yo efikas. Sepandan, kòm ajan abiye teknoloji avans, li enpòtan yo konprann enpak la nan sa yo pansman sou anviwònman an blesi31,32,33. Li te deja rapòte ke pousantaj la ogmante nan re-epitelyalizasyon koresponn ak yon pwopòsyon ogmante nan anti-enflamatwa macrophages M2 konpare ak pro-enflamatwa M1 fenotip la. Sa a te note nan yon modèl sourit anvan kote ajan hydrogel pansman blesi yo te konpare ak sulfadiazine ajan ak hydrogels ki pa antimikrobyen34.
Blesi kwonik ka montre twòp enflamasyon epi li te obsève ke prezans nan neutrofil depase ka prejidis nan geri blese35. Nan yon etid nan sourit neutrofil-apovri, prezans nan netwofil reta reepithelialization. Prezans nan neutrofil depase mennen nan nivo segondè nan proteases ak espès oksijèn reyaktif, tankou superoksid ak oksijene idwojèn, ki asosye avèk kwonik ak ralanti-geri blesi37,38. Menm jan an tou, yon ogmantasyon nan nimewo macrofaj, si san kontwòl, ka mennen nan reta geri blesi39. Ogmantasyon sa a patikilyèman enpòtan si macrophages yo pa kapab tranzisyon soti nan yon fenotip pro-enflamatwa nan yon fenotip pro-geri, sa ki lakòz blesi li pap resevwa yo sòti faz la enflamatwa nan gerizon40. Nou obsève yon diminisyon nan netwofil ak macrophages nan blesi biofilm ki enfekte apre 3 jou nan tretman ak tout pansman an ajan, men diminye a te pi pwononse ak pansman oksijene sèl. Sa a diminye pouvwa gen yon rezilta dirèk nan repons lan iminitè a ajan, yon repons a diminye bioburden, oswa blesi a ke yo te nan yon etap pita nan gerizon ak Se poutèt sa selil iminitè nan blesi a ke yo te redwi. Redui kantite selil enflamatwa nan blesi a ka kenbe yon anviwònman ki favorab pou geri blese. Mekanis nan aksyon nan ki jan Ag oxysalts ankouraje enfeksyon-endepandan gerizon se klè, men kapasite a nan Ag oxysalts yo pwodwi oksijèn ak detwi nivo danjere nan oksijene idwojèn, yon medyatè nan enflamasyon, ka eksplike sa a ak mande pou plis etid17.
Kwonik ki pa geri blesi ki enfekte poze yon pwoblèm pou tou de doktè ak pasyan yo. Malgre ke anpil pansman reklamasyon efikasite antibiotics, rechèch raman konsantre sou lòt faktè kle enfliyanman mikwo -anviwònman an blesi. Etid sa a montre ke diferan teknoloji an ajan gen diferan efikasite antibiotics ak, enpòtan, efè diferan sou anviwònman an blesi ak gerizon, endepandan de enfeksyon. Malgre ke sa yo nan etid in vitro ak nan vivo montre efikasite nan sa yo pansman nan trete enfeksyon blesi ak pwomosyon gerizon, randomized esè kontwole yo bezwen evalye efikasite nan sa yo pansman nan klinik la.
Ansanbl yo itilize ak/oswa analize pandan etid aktyèl la yo disponib nan otè ki koresponn lan sou demann rezonab.
Post tan: Jul-15-2024