Eterogeneite fib misk skelèt imen pi lwen pase chèn lou myozin lan

Mèsi paske ou te vizite nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize dènye vèsyon navigatè a (oswa dezaktive mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Anplis de sa, pou asire sipò kontinyèl, sit sa a p ap gen estil ak JavaScript.
Misk skelèt se yon tisi etewojèn ki konpoze prensipalman de myofibril, ki nan moun yo tipikman klase an twa kalite: youn "ralanti" (tip 1) ak de "rapid" (tip 2A ak 2X). Sepandan, eterogeneite ant ak nan kalite myofibril tradisyonèl yo rete mal konprann. Nou te aplike apwòch transkriptomik ak proteyomik sou 1050 ak 1038 myofibril endividyèl ki soti nan vastus lateralis imen, respektivman. Etid proteyomik la te gen ladan gason, epi etid transkriptomik la te gen ladan 10 gason ak 2 fanm. Anplis izofòm chèn lou myozin yo, nou te idantifye pwoteyin metabolik, pwoteyin ribozomal, ak pwoteyin jonksyon selilè kòm sous varyabilite entèmyofibril miltidimansyonèl. Anplis de sa, malgre idantifikasyon gwoup fib dousman ak rapid, done nou yo sijere ke fib tip 2X yo fenotipikman endistibl de lòt fib rapid. Anplis, klasifikasyon ki baze sou chèn lou myozin lan pa sifi pou dekri fenotip myofib nan myopati nemalin yo. An jeneral, done nou yo sijere yon eterogeneite miltidimansyonèl nan myofib yo, ak sous varyasyon ki pwolonje pi lwen pase izofòm chèn lou myozin lan.
Eterogeneite selilè se yon karakteristik natirèl nan tout sistèm byolojik, ki pèmèt selil yo espesyalize pou satisfè diferan bezwen tisi ak selil yo.1 Pwen de vi tradisyonèl sou eterogeneite fib misk skelèt la se ke newòn motè yo defini kalite fib ki nan yon inite motè, epi ke kalite fib (sa vle di, tip 1, tip 2A, ak tip 2X nan moun) detèmine pa karakteristik izofòm chèn lou myozin (MYH).2 Sa a te okòmansman baze sou enstabilite pH ATPaz yo,3,4 epi pita sou ekspresyon molekilè MYH yo.5 Sepandan, avèk idantifikasyon ak akseptasyon ki vin apre fib "melanje" ki ko-eksprime plizyè MYH nan pwopòsyon varyab, fib misk skelèt yo de pli zan pli wè kòm yon kontinyòm olye ke kòm kalite fib distenk.6 Malgre sa, domèn nan toujou depann anpil sou MYH kòm prensipal klasifikatè pou klasifikasyon myofib, yon pwen de vi ki pwobableman enfliyanse pa limitasyon ak patipri enpòtan nan premye etid wonjè ki gen pwofil ekspresyon MYH ak seri kalite fib diferan de sa yo ki nan moun.2 Sitiyasyon an vin pi konplike pa lefèt ke diferan misk skelèt imen yo montre yon seri divès kalite fib.7 La vastus lateralis se yon misk melanje ak yon pwofil ekspresyon MYH entèmedyè (e pakonsekan reprezantatif).7 Anplis de sa, fasilite echantiyonaj li fè li misk ki pi byen etidye nan moun.
Kidonk, yon envestigasyon san patipri sou divèsite fib misk skelèt yo lè l sèvi avèk zouti "omik" pwisan enpòtan men li difisil tou, an pati akòz nati miltinikleye fib misk skelèt yo. Sepandan, teknoloji transkriptomik8,9 ak pwoteyomik10 yo te sibi yon revolisyon nan sansiblite nan dènye ane yo akòz divès avansman teknolojik, ki pèmèt analiz misk skelèt nan rezolisyon yon sèl fib. Kòm rezilta, yo te fè pwogrè siyifikatif nan karakterizasyon divèsite yon sèl fib ak repons yo a stimuli atrofik ak vyeyisman11,12,13,14,15,16,17,18. Sa ki enpòtan, pwogrè teknolojik sa yo gen aplikasyon klinik, ki pèmèt yon karakterizasyon pi detaye ak presi sou disregilasyon ki asosye ak maladi. Pa egzanp, fizyopatoloji myopati nemalin, youn nan maladi misk eritye ki pi komen yo (MIM 605355 ak MIM 161800), konplèks e konfizyon.19,20 Se poutèt sa, yon pi bon karakterizasyon sou disregilasyon fib misk skelèt yo ta ka mennen nan avansman siyifikatif nan konpreyansyon nou sou maladi sa a.
Nou te devlope metòd pou analiz transkriptomik ak proteyomik fib misk eskelèt endividyèl ki te izole manyèlman nan echantiyon byopsi imen epi nou te aplike yo sou plizyè milye fib, sa ki pèmèt nou envestige eterogeneite selilè fib misk eskelèt imen yo. Nan kou travay sa a, nou te demontre pouvwa fenotipaj transkriptomik ak proteyomik fib misk yo epi nou te idantifye pwoteyin metabolik, ribozomal, ak jonksyon selilè kòm sous enpòtan nan varyabilite entèfib. Anplis de sa, lè l sèvi avèk workflow proteyomik sa a, nou te karakterize enpòtans klinik myopati nematod nan fib misk eskelèt endividyèl yo, sa ki revele yon chanjman kowòdone nan direksyon fib ki pa oksidatif endepandamman de kalite fib ki baze sou MYH.
Pou nou mennen ankèt sou eterogeneite fib misk skelèt imen yo, nou te devlope de workflows pou pèmèt analiz transkriptòm ak pwoteyòm fib misk skelèt endividyèl yo (Figi 1A ak Figi Siplemantè 1A). Nou te devlope epi optimize plizyè etap metodolojik, soti nan depo echantiyon ak prezèvasyon entegrite ARN ak pwoteyin rive nan optimize debi pou chak apwòch. Pou analiz transkriptòm, sa te reyalize lè yo te mete kòd bar molekilè espesifik pou echantiyon nan premye etap transkripsyon envès la, sa ki te pèmèt 96 fib yo te rasanble pou yon pwosesis envès efikas. Sekansaj ki pi pwofon (±1 milyon lekti pa fib) konpare ak apwòch tradisyonèl yon sèl selil yo te anrichi done transkriptòm yo plis toujou. 21 Pou pwoteyomik, nou te itilize yon ti gradyan kromatografik (21 minit) konbine avèk akizisyon done DIA-PASEF sou yon espektwomèt mas timsTOF pou optimize pwofondè pwoteyòm pandan n ap kenbe yon debi ki wo. 22,23 Pou nou mennen ankèt sou eterogeneite fib misk skelèt ki an sante yo, nou te karakterize transkriptòm 1 050 fib endividyèl ki soti nan 14 donatè adilt ki an sante ak pwoteyòm 1 038 fib ki soti nan 5 donatè adilt ki an sante (Tablo Siplemantè 1). Nan atik sa a, nou refere a ansanm done sa yo kòm transkriptòm ak pwoteyòm 1 000 fib, respektivman. Apwòch nou an te detekte yon total de 27 237 transkripsyon ak 2 983 pwoteyin nan analiz transkriptomik ak pwoteyomik 1 000 fib yo (Figi 1A, Ansanm Done Siplemantè 1-2). Apre nou te fin filtre ansanm done transkriptomik ak pwoteyomik yo pou plis pase 1 000 jèn detekte ak 50% valè valab pou chak fib, nou te fè analiz byoenformatik ki vin apre pou 925 ak 974 fib nan transkriptòm ak pwoteyomik la, respektivman. Apre filtraj la, yo te detekte an mwayèn 4257 ± 1557 jèn ak 2015 ± 234 pwoteyin (mwayèn ± SD) pou chak fib, avèk yon varyabilite entè-endividyèl limite (Figi Siplemantè 1B-C, Ansanm Done Siplemantè 3-4). Sepandan, varyabilite nan menm sijè a te pi pwononse nan mitan patisipan yo, pwobableman akòz diferans nan rannman ARN/pwoteyin ant fib ki gen diferan longè ak zòn kwa-seksyonèl. Pou pifò pwoteyin (>2000), koyefisyan varyasyon an te anba 20% (Figi Siplemantè 1D). Toulede metòd yo te pèmèt kaptire yon pakèt transkripsyon ak pwoteyin ki gen siyati ki trè eksprime ki enpòtan pou kontraksyon misk (pa egzanp, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figi Siplemantè 1E-F). Pifò nan karakteristik idantifye yo te komen ant ansanm done transkriptomik ak pwoteyomik yo (Figi Siplemantè 1G), epi entansite mwayèn UMI/LFQ karakteristik sa yo te byen korele (r = 0.52) (Figi Siplemantè 1H).
Travay transkriptomik ak pwoteyomik (kreye avèk BioRender.com). Koub ranje dinamik BD pou MYH7, MYH2, ak MYH1, ak papòt kalkile pou asiyasyon kalite fib. E, F Distribisyon ekspresyon MYH atravè fib yo nan ansanm done transkriptomik ak pwoteyomik. G, H Graf Apwoksimasyon ak Pwojeksyon Divèsite Inifòm (UMAP) pou transkriptomik ak pwoteyomik ki gen koulè pa kalite fib ki baze sou MYH. I, J Graf karakteristik ki montre ekspresyon MYH7, MYH2, ak MYH1 nan ansanm done transkriptomik ak pwoteyomik.
Okòmansman, nou te vle asiyen chak fib yon kalite fib ki baze sou MYH lè l sèvi avèk yon apwòch optimize ki pwofite gwo sansiblite ak seri dinamik ekspresyon MYH nan ansanm done omik yo. Etid anvan yo te itilize papòt abitrè pou make fib yo kòm tip 1 pi, tip 2A, tip 2X, oswa melanje ki baze sou yon pousantaj fiks ekspresyon diferan MYH yo11,14,24. Nou te itilize yon apwòch diferan kote nou te klase ekspresyon chak fib pa MYH nou te itilize pou tip fib yo: MYH7, MYH2, ak MYH1, ki koresponn ak fib tip 1, tip 2A, ak tip 2X, respektivman. Apre sa, nou te kalkile matematikman pwen enfleksyon ki pi ba nan chak koub ki kapab lakòz la epi nou te itilize li kòm yon papòt pou asiyen fib yo kòm pozitif (anlè papòt la) oswa negatif (anba papòt la) pou chak MYH (Figi 1B-D). Done sa yo demontre ke MYH7 (Figi 1B) ak MYH2 (Figi 1C) gen pwofil ekspresyon aktive/dezaktive ki pi diferan nan nivo ARN konpare ak nivo pwoteyin nan. Anfèt, nan nivo pwoteyin nan, trè kèk fib pa t eksprime MYH7, epi pa gen okenn fib ki te gen 100% ekspresyon MYH2. Apre sa, nou te itilize papòt ekspresyon predetèmine pou nou te plase kalite fib ki baze sou MYH nan tout fib nan chak ansanm done. Pa egzanp, fib MYH7+/MYH2-/MYH1- yo te plase nan tip 1, alòske fib MYH7-/MYH2+/MYH1+ yo te plase nan tip melanje 2A/2X (gade Tablo Siplemantè 2 pou deskripsyon konplè a). Lè nou mete tout fib yo ansanm, nou te obsève yon distribisyon remakabman menm jan an nan kalite fib ki baze sou MYH nan tou de nivo ARN (Figi 1E) ak pwoteyin (Figi 1F), alòske konpozisyon relatif kalite fib ki baze sou MYH yo te varye selon moun yo, jan yo te espere a (Figi Siplemantè 2A). Pifò fib yo te klase swa kòm tip 1 pi (34–35%) oswa tip 2A (36–38%), byenke yo te detekte tou yon kantite siyifikatif fib tip melanje 2A/2X (16–19%). Yon diferans frapan se ke fib pi kalite 2X yo te kapab sèlman detekte nan nivo ARN lan, men pa nan nivo pwoteyin lan, sa ki sijere ke ekspresyon rapid MYH la omwen an pati reglemante apre transkripsyon.
Nou te valide metòd tipifikasyon fib MYH nou an ki baze sou pwoteyomik lè l sèvi avèk dot blotting ki baze sou antikò, epi tou de metòd yo te rive nan 100% akò nan idantifye fib pi tip 1 ak tip 2A (gade Figi Siplemantè 2B). Sepandan, apwòch ki baze sou pwoteyomik la te pi sansib, pi efikas nan idantifye fib melanje, ak quantifye pwopòsyon chak jèn MYH nan chak fib. Done sa yo demontre efikasite itilizasyon yon apwòch objektif ki baze sou omik ki trè sansib pou karakterize kalite fib misk skelèt yo.
Apre sa, nou te itilize enfòmasyon konbine ke transkriptomik ak pwoteyomik yo te bay pou nou klase myofib yo objektivman, baze sou transkriptòm konplè yo oubyen pwoteyom yo. Lè nou te itilize metòd apwoksimasyon ak pwojeksyon manifold inifòm (UMAP) pou nou te diminye dimansyonalite a a sis konpozan prensipal (Figi Siplemantè 3A-B), nou te kapab vizyalize varyabilite myofib yo nan transkriptòm nan (Figi 1G) ak pwoteyom nan (Figi 1H). Li enpòtan pou note ke myofib yo pa t gwoupe pa patisipan (Figi Siplemantè 3C-D) oubyen pa jou tès yo (Figi Siplemantè 3E) ni nan ansanm done transkriptomik yo ni nan pwoteyomik yo, sa ki sijere ke varyabilite andedan yon sijè nan fib misk skelèt yo pi wo pase varyabilite ant sijè yo. Nan graf UMAP la, de gwoupman distenk ki reprezante myofib "rapid" ak "dous" yo te parèt (Figi 1G-H). Myofib MYH7+ (dous) yo te gwoupe nan pòl pozitif UMAP1 la, alòske myofib MYH2+ ak MYH1+ (rapid) yo te gwoupe nan pòl negatif UMAP1 la (Figi 1I-J). Sepandan, pa gen okenn distenksyon ki te fèt ant kalite fib rapid yo (sa vle di, tip 2A, tip 2X, oswa melanje 2A/2X) ki baze sou ekspresyon MYH, sa ki sijere ke ekspresyon MYH1 (Figi 1I-J) oswa lòt makè myofib 2X klasik tankou ACTN3 oswa MYLK2 (Figi Siplemantè 4A-B) pa fè diferans ant diferan kalite myofib lè w ap konsidere transkriptòm oswa pwoteyòm nan nèt. Anplis, konpare ak MYH2 ak MYH7, kèk transkripsyon oswa pwoteyin te pozitivman korele ak MYH1 (Figi Siplemantè 4C-H), sa ki sijere ke abondans MYH1 pa reflete nèt transkriptòm/pwoteyòm myofib la. Yo te rive nan menm konklizyon yo lè yo t ap evalye ekspresyon melanje twa izofòm MYH yo nan nivo UMAP la (Figi siplemantè 4I-J). Kidonk, alòske yo ka idantifye fib 2X yo nan nivo transkripsyon an sèlman baze sou kantifikasyon MYH, fib MYH1+ yo pa distenge de lòt fib rapid yo lè yo konsidere tout transkripsyon an oswa pwoteyòm nan.
Kòm yon premye eksplorasyon sou eterogeneite fib dousman ki depase MYH, nou te evalye kat pwoteyin espesifik pou chak kalite fib dousman: TPM3, TNNT1, MYL3, ak ATP2A22. Sou-tip fib dousman yo te montre korelasyon Pearson ki wo, byenke pa pafè, ak MYH7 nan tou de transkriptomik (Figi Siplemantè 5A) ak pwoteyomik (Figi Siplemantè 5B). Apeprè 25% ak 33% nan fib dousman yo pa te klase kòm fib dousman pi pa tout sou-tip jèn/pwoteyin nan transkriptomik (Figi Siplemantè 5C) ak pwoteyomik (Figi Siplemantè 5D), respektivman. Se poutèt sa, klasifikasyon fib dousman ki baze sou plizyè sou-tip jèn/pwoteyin prezante plis konpleksite, menm pou pwoteyin ke yo konnen ki espesifik pou yon kalite fib. Sa sijere ke klasifikasyon fib ki baze sou izofòm yon sèl fanmi jèn/pwoteyin ka pa reflete byen vrè eterogeneite fib misk skelèt yo.
Pou nou eksplore plis varyabilite fenotipik fib misk skelèt imen yo nan echèl modèl omik konplè a, nou te fè yon rediksyon dimansyonalite san patipri nan done yo lè l sèvi avèk analiz eleman prensipal (PCA) (Figi 2A). Menm jan ak graf UMAP yo, ni patisipan an ni jou tès la pa t enfliyanse gwoupman fib yo nan nivo PCA a (Figi Siplemantè 6A-C). Nan tou de ansanm done yo, kalite fib ki baze sou MYH te eksplike pa PC2, ki te montre yon gwoupman fib tip 1 ki gen kontraksyon dousman ak yon dezyèm gwoupman ki gen fib tip 2A ki gen kontraksyon rapid, tip 2X, ak fib melanje 2A/2X (Figi 2A). Nan tou de ansanm done yo, de gwoupman sa yo te konekte pa yon ti kantite fib melanje tip 1/2A. Jan yo te espere a, analiz surreprezantasyon prensipal chofè PC yo te konfime ke PC2 te kondwi pa siyati kontraktil ak metabolik (Figi 2B ak Figi Siplemantè 6D-E, Ansanm Done Siplemantè 5-6). An jeneral, yo te jwenn ke kalite fib ki baze sou MYH te sifizan pou eksplike varyasyon kontinyèl sou PC2, eksepte sa yo rele fib 2X ki te distribye nan tout transkriptòm nan nan gwoup rapid la.
A. Grafik analiz konpozan prensipal (PCA) nan ansanm done transkriptòm ak pwoteyòm ki gen koulè selon kalite fib ki baze sou MYH. B. Analiz anrichisman chofè transkripsyon ak pwoteyin nan PC2 ak PC1. Analiz estatistik te fèt lè l sèvi avèk pake clusterProfiler ak valè p ajiste pa Benjamini-Hochberg. C, D. Grafik PCA ki gen koulè selon tèm ontoloji jèn adezyon entèselilè (GO) nan transkriptòm nan ak tèm GO kostamè nan pwoteyòm nan. Flèch yo reprezante chofè transkripsyon ak pwoteyin ak direksyon yo. E, F. Grafik karakteristik apwoksimasyon ak pwojeksyon manifold inifòm (UMAP) nan karakteristik klinikman enpòtan ki montre gradyan ekspresyon endepandan de kalite fib dousman/rapid. G, H. Korelasyon ant chofè PC2 ak PC1 nan transkriptòm ak pwoteyòm.
Sanzatann, kalite myofib ki baze sou MYH la te eksplike sèlman dezyèm pi gwo degre varyabilite a (PC2), sa ki sijere ke lòt faktè byolojik ki pa gen rapò ak kalite myofib ki baze sou MYH (PC1) jwe yon wòl enpòtan nan reglemante eterogeneite fib misk skelèt yo. Analiz surreprezantasyon prensipal faktè ki pi enpòtan yo nan PC1 te revele ke varyabilite nan PC1 te prensipalman detèmine pa adezyon selil-selil ak kontni ribozòm nan transkriptòm nan, ak kostamè ak pwoteyin ribozomal nan pwoteyòm nan (Figi 2B ak Figi Siplemantè 6D-E, Ansanm Done Siplemantè 7). Nan misk skelèt, kostamè yo konekte disk Z a ak sarkolèm nan epi yo enplike nan transmisyon fòs ak siyalizasyon. 25 Graf PCA anote ki itilize karakteristik adezyon selil-selil (transkriptòm, Figi 2C) ak kostamè (pwoteyòm, Figi 2D) te revele yon gwo deplasman agoch ​​nan PC1, sa ki endike ke karakteristik sa yo rich nan sèten fib.
Yon egzamen pi detaye sou gwoupman myofib nan nivo UMAP la te revele ke pifò karakteristik yo te montre yon gradyan ekspresyon MYH ki endepandan de kalite myofib olye ke espesifik pou yon sou-gwoupman myofib. Yo te obsève kontinwite sa a pou plizyè jèn ki asosye ak kondisyon patolojik (Figi 2E), tankou CHCHD10 (maladi newomiskilè), SLIT3 (atrofi miskilè), CTDNEP1 (maladi miskilè). Yo te obsève kontinwite sa a tou atravè pwoteyòm nan, ki gen ladan pwoteyin ki asosye ak twoub newolojik (UGDH), siyalizasyon ensilin (PHIP), ak transkripsyon (HIST1H2AB) (Figi 2F). Ansanm, done sa yo endike kontinwite nan eterogeneite kontraksyon ralanti/rapid endepandan de kalite fib atravè diferan myofib.
Sa ki enteresan, jèn chofè nan PC2 yo te montre yon bon korelasyon transkriptòm-pwoteyòm (r = 0.663) (Figi 2G), sa ki sijere ke kalite fib ki gen kontraksyon dousman ak rapid, e an patikilye pwopriyete kontraktil ak metabolik fib misk skelèt yo, yo reglemante transkripsyonèlman. Sepandan, jèn chofè nan PC1 yo pa t montre okenn korelasyon transkriptòm-pwoteyòm (r = -0.027) (Figi 2H), sa ki sijere ke varyasyon ki pa gen rapò ak kalite fib ki gen kontraksyon dousman/rapid yo lajman reglemante apre transkripsyonèlman. Piske varyasyon nan PC1 yo te prensipalman eksplike pa tèm ontoloji jèn ribozomal, e etandone ke ribozòm yo jwe yon wòl enpòtan ak espesyalize nan selil la lè yo patisipe aktivman nan epi enfliyanse tradiksyon pwoteyin,31 nou te deside apre sa envestige eterogeneite ribozomal inatandi sa a.
Nou te premye kolore graf analiz konpozan prensipal pwoteyomik la dapre abondans relatif pwoteyin yo nan tèm GOCC "ribozòm sitoplasmik" (Figi 3A). Malgre ke tèm sa a rich sou bò pozitif PC1 la, sa ki lakòz yon ti gradyan, pwoteyin ribozomal yo kondwi patisyon nan tou de direksyon PC1 (Figi 3A). Pwoteyin ribozomal ki rich sou bò negatif PC1 yo te gen ladan RPL18, RPS18, ak RPS13 (Figi 3B), pandan ke RPL31, RPL35, ak RPL38 (Figi 3C) te prensipal motè yo sou bò pozitif PC1 la. Sa ki enteresan, RPL38 ak RPS13 te trè eksprime nan misk skelèt konpare ak lòt tisi yo (Figi Siplemantè 7A). Siyati ribozomal diferan sa yo nan PC1 pa te obsève nan transkriptòm nan (Figi Siplemantè 7B), sa ki endike règleman pòs-transkripsyonèl.
A. Graf analiz konpozan prensipal (PCA) ki gen koulè dapre tèm ontoloji jèn ribozomal sitoplasmik (GO) atravè pwoteyòm nan. Flèch yo endike direksyon varyasyon ki medyatè pa pwoteyin nan graf PCA a. Longè liy lan koresponn ak nòt konpozan prensipal pou yon pwoteyin bay. B, C. Graf karakteristik PCA pou RPS13 ak RPL38. D. Analiz gwoupman yerarchik san sipèvizyon pwoteyin ribozomal sitoplasmik yo. E. Modèl estriktirèl ribozòm 80S la (PDB: 4V6X) ki mete aksan sou pwoteyin ribozomal ki gen diferan abondans nan fib misk skelèt yo. F. Pwoteyin ribozomal ki gen diferan stokyometri lokalize toupre kanal sòti mRNA a.
Yo te pwopoze deja konsèp eterogeneite ak espesyalizasyon ribozomal yo, kote prezans soupopilasyon ribozòm distenk (etewogeneite ribozomal) ka enfliyanse dirèkteman tradiksyon pwoteyin nan diferan tisi32 ak selil33 atravè tradiksyon selektif pisin transkripsyon mRNA espesifik34 (espesyalizasyon ribozòm). Pou idantifye soupopilasyon pwoteyin ribozomal ki ko-eksprime nan fib misk skelèt yo, nou te fè yon analiz gwoupman yerarchik san sipèvizyon nan pwoteyin ribozomal nan pwoteyòm nan (Figi 3D, Ansanm Done Siplemantè 8). Jan yo te espere a, pwoteyin ribozomal yo pa t gwoupe pa kalite fib ki baze sou MYH. Sepandan, nou te idantifye twa gwoupman distenk nan pwoteyin ribozomal; premye gwoupman an (ribozomal_cluster_1) ko-reglemante ak RPL38 e pakonsekan li gen yon ekspresyon ogmante nan fib ki gen yon pwofil PC1 pozitif. Dezyèm gwoupman an (ribozomal_cluster_2) ko-reglemante ak RPS13 epi li ogmante nan fib ki gen yon pwofil PC1 negatif. Twazyèm gwoupman an (ribozomal_cluster_3) pa montre ekspresyon diferansyèl kowòdone nan fib misk skelèt yo epi yo ka konsidere li kòm pwoteyin ribozomal "nwayo" misk skelèt la. Tou de gwoupman ribozomal 1 ak 2 yo gen pwoteyin ribozomal ki te deja montre yo kontwole tradiksyon altènatif (pa egzanp, RPL10A, RPL38, RPS19, ak RPS25) epi ki enfliyanse devlopman fonksyonèlman (pa egzanp, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 An akò ak rezilta PCA yo, reprezantasyon etewojèn pwoteyin ribozomal sa yo atravè fib yo te montre tou kontinwite (Figi Siplemantè 7C).
Pou nou te ka wè kote pwoteyin ribozomal etewojèn yo ye nan ribozòm nan, nou te itilize yon modèl estriktirèl ribozòm 80S imen an (Protein Data Bank: 4V6X) (Figi 3E). Apre nou te fin izole pwoteyin ribozomal ki fè pati diferan gwoup ribozomal, kote yo te ye a pa t byen aliyen, sa ki sijere ke apwòch nou an pa t rive bay anrichisman pou sèten rejyon/fraksyon ribozòm nan. Sepandan, sa ki enteresan, pwopòsyon pwoteyin gwo sou-inite nan gwoup 2 a te pi ba pase nan gwoup 1 ak 3 yo (Figi Siplemantè 7D). Nou te obsève ke pwoteyin ki gen stokiyometri modifye nan fib misk skelèt yo te sitou lokalize sou sifas ribozòm nan (Figi 3E), sa ki konsistan avèk kapasite yo pou kominike avèk eleman sit antre ribozòm entèn (IRES) nan diferan popilasyon mRNA, kidonk kowòdone tradiksyon selektif. 40, 41 Anplis de sa, anpil pwoteyin ki gen stokiyometri modifye nan fib misk skelèt yo te sitiye toupre rejyon fonksyonèl tankou tinèl sòti mRNA a (Figi 3F), ki kontwole elongasyon tradiksyonèl ak arestasyon peptid espesifik yo yon fason selektif. 42 An rezime, done nou yo sijere ke stokyometri pwoteyin ribozomal misk skelèt yo montre eterogeneite, sa ki lakòz diferans ant fib misk skelèt yo.
Apre sa, nou te deside idantifye siyati fib rapid ak dousman epi eksplore mekanis regilasyon transkripsyonèl yo. Lè nou konpare gwoup fib rapid ak dousman defini pa UMAP nan de ansanm done yo (Figi 1G-H ak 4A-B), analiz transkriptomik ak pwoteyomik yo te idantifye 1366 ak 804 karakteristik abondan diferansyèlman, respektivman (Figi 4A-B, Ansanm Done Siplemantè 9-12). Nou te obsève diferans yo te espere nan siyati ki gen rapò ak sarkomè yo (pa egzanp, tropomyozin ak troponin), kouplaj eksitasyon-kontraksyon (izofòm SERCA), ak metabolis enèji (pa egzanp, ALDOA ak CKB). Anplis, transkripsyon ak pwoteyin ki reglemante ubikitinasyon pwoteyin yo te eksprime diferansyèlman nan fib rapid ak dousman (pa egzanp, USP54, SH3RF2, USP28, ak USP48) (Figi 4A-B). Anplis, jèn pwoteyin mikwòb RP11-451G4.2 (DWORF) la, ki te deja montre ke li eksprime yon fason diferan atravè kalite fib misk ti mouton43 epi ki amelyore aktivite SERCA nan misk kadyak44, te siyifikativman ogmante nan fib misk skelèt dousman (Figi 4A). Menm jan an tou, nan nivo fib endividyèl la, yo te obsève diferans enpòtan nan siyati li te ye tankou izofòm laktat dezidrogenaz ki gen rapò ak metabolis (LDHA ak LDHB, Figi 4C ak Figi Siplemantè 8A)45,46 ansanm ak siyati espesifik pou kalite fib ki pa t konnen anvan (tankou IRX3, USP54, USP28, ak DPYSL3) (Figi 4C). Te gen yon sipèpoze enpòtan nan karakteristik ki eksprime yon fason diferan ant ansanm done transkriptomik ak pwoteyomik yo (Figi Siplemantè 8B), ansanm ak yon korelasyon chanjman pli ki te kondwi sitou pa ekspresyon diferansyèl ki pi pwononse nan karakteristik sarkomè yo (Figi Siplemantè 8C). Li enpòtan pou note ke gen kèk siyati (pa egzanp USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ki te montre yon gwo regilasyon pòs-transkripsyonèl sèlman nan nivo pwoteyomik la epi ki te gen pwofil ekspresyon espesifik pou kalite fib ki gen kontraksyon ralanti/rapid (Figi Siplemantè 8C).
Grafik vòlkan A ak B k ap konpare gwoupman dousman ak rapid idantifye pa graf apwoksimasyon ak pwojeksyon manifold inifòm (UMAP) nan Figi 1G-H. Pwen koulè yo reprezante transkripsyon oswa pwoteyin ki siyifikativman diferan nan FDR < 0.05, epi pwen ki pi fonse yo reprezante transkripsyon oswa pwoteyin ki siyifikativman diferan nan chanjman logaritmik > 1. Analiz estatistik bidireksyonèl te fèt lè l sèvi avèk tès DESeq2 Wald la ak valè p ajiste Benjamini-Hochberg (transkriptomik) oswa metòd modèl lineyè Limma a ak analiz Bayesyen anpirik ki te swiv pa ajisteman Benjamini-Hochberg pou konparezon miltip (pwoteyomik). C Grafik siyati jèn oswa pwoteyin ki eksprime diferansyèlman chwazi ant fib dousman ak rapid yo. D Analiz anrichisman transkripsyon ak pwoteyin ki eksprime diferansyèlman siyifikativman. Valè ki sipèpoze yo anrichi nan tou de ansanm done yo, valè transkripsyon yo anrichi sèlman nan transkriptòm nan, epi valè pwoteyòm yo anrichi sèlman nan pwoteyòm nan. Analiz estatistik la te fèt lè l sèvi avèk pake clusterProfiler la ak valè p ajiste Benjamini-Hochberg. E. Faktè transkripsyon espesifik pou chak kalite fib idantifye pa SCENIC ki baze sou nòt espesifikite regilatè ki sòti nan SCENIC ak ekspresyon diferansyèl mRNA ant kalite fib yo. F. Pwofilaj faktè transkripsyon chwazi ki eksprime diferansyèlman ant fib dousman ak rapid yo.
Apre sa, nou te fè yon analiz surreprezantasyon jèn ak pwoteyin ki reprezante yon fason diferan (Figi 4D, Ansanm Done Siplemantè 13). Anrichisman chemen pou karakteristik ki diferan ant de ansanm done yo te revele diferans yo te espere, tankou pwosesis β-oksidasyon asid gra ak metabolis ketòn (fib dousman), kontraksyon myofilaman/misk (fib rapid ak dousman, respektivman), ak pwosesis katabolik idrat kabòn (fib rapid). Aktivite fosfataz pwoteyin serin/treonin te ogmante tou nan fib rapid yo, akòz karakteristik tankou sou-inite fosfataz regilatè ak katalitik yo (PPP3CB, PPP1R3D, ak PPP1R3A), ki li te ye pou kontwole metabolis glikojèn (47) (Figi Siplemantè 8D-E). Lòt chemen ki te rich nan fib rapid yo te enkli kò pwosesis (P-) yo (YTHDF3, TRIM21, LSM2) nan pwoteyòm nan (Figi siplemantè 8F), ki potansyèlman enplike nan règleman pòs-transkripsyon (48), ak aktivite faktè transkripsyon (SREBF1, RXRG, RORA) nan transkriptòm nan (Figi siplemantè 8G). Fib dousman yo te rich nan aktivite oksidorediktaz (BDH1, DCXR, TXN2) (Figi siplemantè 8H), lyezon amid (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figi siplemantè 8I), matris ekstraselilè (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figi siplemantè 8J), ak aktivite ligand reseptè (FNDC5, SPX, NENF) (Figi siplemantè 8K).
Pou nou te ka pi byen konprann règleman transkripsyon ki dèyè karakteristik fib miskilè rapid/dous, nou te fè yon analiz anrichisman faktè transkripsyon lè l sèvi avèk SCENIC49 (Ansanm Done Siplemantè 14). Anpil faktè transkripsyon te anrichi anpil ant fib miskilè rapid ak ralanti (Figi 4E). Sa te gen ladan faktè transkripsyon tankou MAFA, ki te deja lye ak devlopman fib miskilè rapid,50 ansanm ak plizyè faktè transkripsyon ki pa t deja asosye ak pwogram jèn espesifik pou kalite fib miskilè. Pami sa yo, PITX1, EGR1, ak MYF6 te faktè transkripsyon ki pi anrichi nan fib miskilè rapid yo (Figi 4E). Okontrè, ZSCAN30 ak EPAS1 (ke yo rele tou HIF2A) te faktè transkripsyon ki pi anrichi nan fib miskilè ralanti yo (Figi 4E). An akò avèk sa, MAFA te eksprime nan nivo ki pi wo nan rejyon UMAP ki koresponn ak fib miskilè rapid yo, pandan ke EPAS1 te gen modèl ekspresyon opoze a (Figi 4F).
Anplis jèn ki kode pwoteyin yo, gen anpil byotip ARN ki pa kode ki ka enplike nan regilasyon devlopman ak maladi imen. 51, 52 Nan ​​ansanm done transkriptòm yo, plizyè ARN ki pa kode montre espesifikite kalite fib (Figi 5A ak Ansanm Done Siplemantè 15), tankou LINC01405, ki trè espesifik pou fib dousman epi yo rapòte ke li diminye nan misk pasyan ki gen myopati mitokondriyal. 53 Okontrè, RP11-255P5.3, ki koresponn ak jèn lnc-ERCC5-5 la (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, montre espesifikite kalite fib rapid. Tou de LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ak RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) montre espesifikasyon nan misk skelèt (Figi Siplemantè 9A-B) epi yo pa gen okenn jèn kontraktil li te ye nan vwazinaj jenomik 1 Mb yo a, sa ki sijere ke yo jwe yon wòl espesyalize nan reglemante kalite fib olye ke reglemante jèn kontraktil vwazen yo. Pwofil ekspresyon espesifik kalite fib ralanti/rapid LINC01405 ak RP11-255P5.3 yo, respektivman, te konfime lè l sèvi avèk RNAscope (Figi 5B-C).
A. Transkripsyon ARN ki pa kodan yo reglemante anpil nan fib misk ki gen kontraksyon dousman ak rapid. B. Imaj reprezantatif RNAscope ki montre espesifikite kalite fib ki gen kontraksyon dousman ak rapid LINC01405 ak RP11-255P5.3, respektivman. Ba echèl = 50 μm. C. Kantifikasyon ekspresyon ARN ki pa kodan espesifik kalite myofib jan RNAscope detèmine l (n = 3 byopsi ki soti nan moun endepandan, konpare fib misk rapid ak ralanti nan chak moun). Analiz estatistik te fèt lè l sèvi avèk yon tès t Student bilateral. Dyagram bwat yo montre medyàn lan ak premye ak twazyèm katil yo, ak moustach ki montre valè minimòm ak maksimòm yo. D. Pwosesis idantifikasyon pwoteyin mikwòb de novo (kreye avèk BioRender.com). E. Pwoteyin mikwòb LINC01405_ORF408:17441:17358 la eksprime espesyalman nan fib misk skelèt ralanti (n=5 byopsi ki soti nan patisipan endepandan, konpare fib misk rapid ak ralanti nan chak patisipan). Yo te fè analiz estatistik la avèk metòd modèl lineyè Limm lan konbine avèk yon apwòch Bayesyen anpirik, epi apre sa yo te itilize metòd Benjamini-Hochberg la pou konparezon miltip ak ajisteman valè p. Dyagram bwat yo montre medyàn lan, premye ak twazyèm katil la, avèk moustach ki montre valè maksimòm/minimòm yo.
Dènyèman, etid yo montre ke anpil swadizan transkripsyon ki pa kodan kode pwoteyin mikwòb transkri, kèk ladan yo reglemante fonksyon misk yo. 44, 55 Pou idantifye pwoteyin mikwòb ki gen espesifikasyon potansyèl pou kalite fib, nou te fouye nan seri done pwoteyòm 1000 fib nou an lè l sèvi avèk yon fichye FASTA koutim ki gen sekans transkripsyon ki pa kodan yo (n = 305) yo te jwenn nan seri done transkripsyon 1000 fib la (Figi 5D). Nou te idantifye 197 pwoteyin mikwòb ki soti nan 22 transkripsyon diferan, 71 ladan yo te reglemante yon fason diferan ant fib misk skelèt dousman ak rapid (Figi Siplemantè 9C ak Seri Done Siplemantè 16). Pou LINC01405, nou te idantifye twa pwodui pwoteyin mikwòb, youn ladan yo te montre yon espesifikasyon fib dousman menm jan ak transkripsyon li a (Figi 5E ak Figi Siplemantè 9D). Kidonk, nou te idantifye LINC01405 kòm yon jèn ki kode yon pwoteyin mikwòb espesifik pou fib misk skelèt dousman.
Nou te devlope yon workflow konplè pou karakterizasyon pwoteyomik sou gwo echèl fib misk endividyèl yo epi nou te idantifye regilatè eterogeneite fib nan eta ki an sante. Nou te aplike workflow sa a pou konprann kijan myopati nemalin yo afekte eterogeneite fib misk skelèt yo. Myopati nemalin yo se maladi misk eritye ki lakòz feblès nan misk epi, nan timoun ki afekte yo, prezante ak yon seri konplikasyon tankou detrès respiratwa, eskolyoz, ak mobilite limite nan manm yo. 19,20 Tipikman, nan myopati nemalin yo, varyant patojèn nan jèn tankou aktin alfa 1 (ACTA1) lakòz yon predominans konpozisyon myofib fib ki gen kontraksyon dousman, byenke efè sa a eterogene. Yon eksepsyon remakab se myopati nemalin troponin T1 (TNNT1), ki gen yon predominans fib rapid. Kidonk, yon pi bon konpreyansyon sou eterogeneite ki kache dèyè deregleman fib misk skelèt yo obsève nan myopati nemalin yo ka ede demele relasyon konplèks ki genyen ant maladi sa yo ak kalite myofib.
Konpare ak temwen ki an sante yo (n=3 pa gwoup), myofib ki te izole nan pasyan ki gen myopati nemalin ki gen mitasyon nan jèn ACTA1 ak TNNT1 yo te montre yon atrofi oswa distrofi myofib ki make (Figi 6A, Tablo Siplemantè 3). Sa te prezante gwo defi teknik pou analiz pwoteyomik akòz kantite limite materyèl ki disponib la. Malgre sa, nou te kapab detekte 2485 pwoteyin nan 272 myofib skelèt. Apre filtraj pou omwen 1000 pwoteyin kantifye pa fib, 250 fib te sibi analiz byoenformatik ki vin apre. Apre filtraj, yon mwayèn de 1573 ± 359 pwoteyin pa fib te kantifye (Figi Siplemantè 10A, Ansanm Done Siplemantè 17-18). Li enpòtan pou note ke, malgre rediksyon siyifikatif nan gwosè fib la, pwofondè pwoteyom echantiyon pasyan ki gen myopati nemalin yo te sèlman redwi yon ti kras. Anplis, tretman done sa yo lè l sèvi avèk pwòp fichye FASTA nou yo (ki gen ladan transkripsyon ki pa kodaj) te pèmèt nou idantifye senk pwoteyin mikwòb nan myofib skelèt ki soti nan pasyan ki gen myopati nemalin (Ansanm Done Siplemantè 19). Ranje dinamik pwoteyòm nan te siyifikativman pi laj, epi pwoteyin total nan gwoup kontwòl la te byen korele ak rezilta yon analiz pwoteyòm 1000 fib anvan an (Figi Siplemantè 10B-C).
A. Imaj mikwoskopik ki montre atrofi oswa distrofi fib ak predominans diferan kalite fib ki baze sou MYH nan myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 (NM). Ba echèl = 100 μm. Pou asire repwodiktibilite kolorasyon nan pasyan ACTA1 ak TNNT1, twa byopsi pasyan yo te kolore de a twa fwa (kat seksyon pa ka) anvan yo te chwazi imaj reprezantatif. B. Pwopòsyon kalite fib nan patisipan yo ki baze sou MYH. C. Graf analiz eleman prensipal (PCA) nan fib misk skelèt nan pasyan ki gen myopati nemalin ak kontwòl. D. Fib misk skelèt ki soti nan pasyan ki gen myopati nemalin ak kontwòl projeté sou yon graf PCA detèmine apati 1000 fib yo analize nan Figi 2. Pa egzanp, graf vòlkan ki konpare diferans ki genyen ant patisipan ki gen myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 ak kontwòl, ak ant patisipan ki gen myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1. Sèk ki gen koulè yo endike pwoteyin ki te siyifikativman diferan nan π < 0.05, epi pwen nwa yo endike pwoteyin ki te siyifikativman diferan nan FDR < 0.05. Analiz estatistik la te fèt lè l sèvi avèk metòd modèl lineyè Limma a ak metòd Bayesian anpirik yo, epi apre sa, yo te ajiste valè p pou plizyè konparezon lè l sèvi avèk metòd Benjamini-Hochberg la. H. Analiz anrichisman pwoteyin ki gen ekspresyon diferansyèl siyifikativman atravè tout pwoteyòm nan ak nan fib tip 1 ak 2A yo. Analiz estatistik la te fèt lè l sèvi avèk pake clusterProfiler la epi valè p ajiste pa Benjamini-Hochberg. I, J. Graf analiz konpozan prensipal (PCA) ki gen koulè pa tèm matris ekstraselilè ak ontoloji jèn mitokondriyal (GO).
Paske myopati nemalin yo ka enfliyanse pwopòsyon kalite myofib ki eksprime MYH nan misk skelèt,19,20 nou te premye egzamine kalite myofib ki eksprime MYH yo nan pasyan ki gen myopati nemalin ak temwen. Nou te detèmine kalite myofib la lè l sèvi avèk yon metòd san patipri ki te dekri deja pou tès 1000 myofib la (Figi siplemantè 10D-E) epi ankò yon fwa nou pa t rive idantifye myofib 2X pi (Figi 6B). Nou te obsève yon efè etewojèn myopati nemalin yo sou kalite myofib, paske de pasyan ki gen mitasyon ACTA1 te gen yon pwopòsyon ogmante nan myofib tip 1, tandiske de pasyan ki gen myopati nemalin TNNT1 te gen yon pwopòsyon diminye nan myofib tip 1 (Figi 6B). Anfèt, ekspresyon izofòm MYH2 ak troponin rapid yo (TNNC2, TNNI2, ak TNNT3) te diminye nan myopati ACTA1-nemalin, alòske ekspresyon MYH7 te diminye nan myopati TNNT1-nemalin (Figi Siplemantè 11A). Sa konsistan avèk rapò anvan yo sou chanjman kalite myofib etewojèn nan myopati nemalin.19,20 Nou te konfime rezilta sa yo pa imunoistochimi epi nou te jwenn ke pasyan ki gen myopati ACTA1-nemalin te gen yon predominans myofib tip 1, alòske pasyan ki gen myopati TNNT1-nemalin te gen modèl opoze a (Figi 6A).
Nan nivo pwoteyòm yon sèl fib la, fib misk skelèt ki soti nan pasyan ki gen myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 yo te gwoupe ak majorite fib kontwòl yo, ak fib myopati nemalin TNNT1 yo jeneralman te pi afekte yo (Figi 6C). Sa te patikilyèman evidan lè yo te trase graf analiz eleman prensipal (PCA) fib pseudo-gonfle pou chak pasyan, ak pasyan myopati nemalin TNNT1 2 ak 3 ki parèt pi lwen echantiyon kontwòl yo (Figi Siplemantè 11B, Ansanm Done Siplemantè 20). Pou pi byen konprann kijan fib ki soti nan pasyan myopati yo konpare ak fib ki an sante, nou te itilize enfòmasyon detaye ki te jwenn nan analiz pwoteyomik 1,000 fib ki soti nan patisipan adilt ki an sante. Nou te projeté fib ki soti nan ansanm done myopati a (pasyan ak kontwòl ki gen myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1) sou graf PCA ki te jwenn nan analiz pwoteyomik 1000 fib la (Figi 6D). Distribisyon kalite fib MYH yo sou PC2 nan fib kontwòl yo te sanble ak distribisyon fib ki te jwenn nan analiz pwoteyomik 1000 fib la. Sepandan, pifò fib nan pasyan ki gen myopati nemalin yo te deplase desann PC2, sipèpoze ak fib rapid ki an sante, kèlkeswa kalite fib MYH natif natal yo. Kidonk, byenke pasyan ki gen myopati nemalin ACTA1 yo te montre yon chanjman nan direksyon fib tip 1 lè yo te quantifye yo lè l sèvi avèk metòd ki baze sou MYH, tou de myopati nemalin ACTA1 ak myopati nemalin TNNT1 te deplase pwoteyom fib misk skelèt la nan direksyon fib rapid yo.
Apre sa, nou te konpare chak gwoup pasyan dirèkteman ak temwen ki an sante epi nou te idantifye 256 ak 552 pwoteyin ki te eksprime yon fason diferan nan myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1, respektivman (Figi 6E-G ak Figi Siplemantè 11C, Ansanm Done Siplemantè 21). Analiz anrichisman jèn te revele yon diminisyon kowòdone nan pwoteyin mitokondriyal yo (Figi 6H-I, Ansanm Done Siplemantè 22). Etonan, malgre predominans diferansyèl kalite fib yo nan myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1, diminisyon sa a te konplètman endepandan de kalite fib ki baze sou MYH la (Figi 6H ak Figi Siplemantè 11D-I, Ansanm Done Siplemantè 23). Twa pwoteyin mikwòb yo te reglemante tou nan myopati nemalin ACTA1 oswa TNNT1. De nan mikwopwoteyin sa yo, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ke yo rele tou LINC00598 oswa Lnc-FOXO1) ak ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), te montre yon abondans diferans sèlman nan myofib tip 1 yo. Yo te deja rapòte ke ENSG00000215483_TR14_ORF67 jwe yon wòl nan règleman sik selilè. 56 Yon lòt bò, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (ki koresponn ak LINC01798) te ogmante nan tou de myofib tip 1 ak tip 2A nan myopati ACTA1-nemalin konpare ak temwen ki an sante (Figi Siplemantè 12A, Ansanm Done Siplemantè 24). Okontrè, pwoteyin ribozomal yo pa te afekte anpil pa myopati nemalin, byenke RPS17 te diminye nan myopati nemalin ACTA1 (Fig. 6E).
Analiz anrichisman an te revele tou yon ogmantasyon nan pwosesis sistèm iminitè yo nan myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 yo, alòske adezyon selilè a te ogmante tou nan myopati nemalin TNNT1 (Figi 6H). Anrichisman faktè ekstraselilè sa yo te reflete pa pwoteyin matris ekstraselilè yo ki deplase PCA nan PC1 ak PC2 nan yon direksyon negatif (sa vle di, nan direksyon fib ki pi afekte yo) (Figi 6J). Toulede gwoup pasyan yo te montre yon ogmantasyon nan ekspresyon pwoteyin ekstraselilè ki enplike nan repons iminitè yo ak mekanis reparasyon sarkolemal yo, tankou aneksin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ak pwoteyin entèaktif yo S100A1159 (Figi Siplemantè 12B-C). Yo te deja rapòte pwosesis sa a kòm amelyore nan distrofi miskilè60 men, nan konesans nou, li pa t janm asosye avèk myopati nemalin anvan. Fonksyon nòmal machin molekilè sa a nesesè pou reparasyon sarkolemal apre yon blesi ak pou fizyon myosit ki fèk fòme ak myofib58,61. Kidonk, ogmantasyon aktivite pwosesis sa a nan tou de gwoup pasyan yo sijere yon repons reparatif a blesi ki koze pa enstabilite myofib la.
Efè chak myopati nemalin yo te byen korele (r = 0.736) epi yo te montre yon sipèpoze rezonab (Figi Siplemantè 11A-B), sa ki endike ke myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 gen efè menm jan an sou pwoteyòm nan. Sepandan, gen kèk pwoteyin ki te reglemante sèlman nan myopati nemalin ACTA1 oswa TNNT1 (Figi Siplemantè 11A ak C). Pwoteyin profibrotik MFAP4 la te youn nan pwoteyin ki te pi reglemante nan myopati nemalin TNNT1 men li te rete san chanjman nan myopati nemalin ACTA1. SKIC8, yon eleman nan konplèks PAF1C ki responsab pou reglemante transkripsyon jèn HOX, te desann nan myopati nemalin TNNT1 men li pa t afekte nan myopati nemalin ACTA1 (Figi Siplemantè 11A). Konparezon dirèk myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 te revele pi gwo rediksyon nan pwoteyin mitokondriyal ak ogmantasyon nan pwoteyin sistèm iminitè nan myopati nemalin TNNT1 (Figi 6G-H ak Figi Siplemantè 11C ak 11H-I). Done sa yo konsistan avèk pi gwo atrofi/distrofi obsève nan myopati nemalin TNNT1 konpare ak myopati nemalin TNNT1 (Figi 6A), sa ki sijere ke myopati nemalin TNNT1 reprezante yon fòm maladi a ki pi grav.
Pou evalye si efè myopati nemalin yo obsève a pèsiste nan tout nivo misk la, nou te fè yon analiz pwoteyomik an mas sou byopsi misk ki soti nan menm gwoup pasyan ki gen myopati nemalin TNNT1 yo epi nou te konpare yo ak gwoup kontwòl yo (n=3 pa gwoup) (Fig. Siplemantè 13A, Seri Done Siplemantè 25). Jan yo te prevwa a, gwoup kontwòl yo te gen yon relasyon sere sere nan analiz eleman prensipal yo, alòske pasyan ki gen myopati nemalin TNNT1 yo te montre yon varyabilite entèechantiyon ki pi wo, menm jan ak sa yo wè nan analiz yon sèl fib (Fig. Siplemantè 13B). Analiz an mas la te repwodui pwoteyin ki eksprime yon fason diferan (Fig. Siplemantè 13C, Seri Done Siplemantè 26) ak pwosesis byolojik yo (Fig. Siplemantè 13D, Seri Done Siplemantè 27) ki te parèt lè yo te konpare fib endividyèl yo, men li te pèdi kapasite pou distenge ant diferan kalite fib epi li pa t pran an kont efè maladi etewojèn atravè fib yo.
Lè nou mete tout done sa yo ansanm, yo demontre ke pwoteyomik yon sèl myofib ka klarifye karakteristik byolojik klinik ki pa ka detekte pa metòd siblé tankou imunoblotting. Anplis de sa, done sa yo mete aksan sou limit ki genyen nan itilizasyon tipifikasyon fib aktin (MYH) sèlman pou dekri adaptasyon fenotipik. Anfèt, byenke chanjman kalite fib diferan ant myopati nemalin aktin ak troponin, tou de myopati nemalin yo dekonekte tipifikasyon fib MYH ak metabolis fib misk skelèt pou yon pwoteyom misk ki pi rapid e mwens oksidatif.
Eterogeneite selilè enpòtan pou tisi yo satisfè divès demand yo. Nan misk skelèt, sa souvan dekri kòm kalite fib ki karakterize pa diferan degre pwodiksyon fòs ak fatigabilite. Sepandan, li klè ke sa eksplike sèlman yon ti pati nan varyabilite fib misk skelèt la, ki pi varyab, konplèks ak miltifasèt pase sa yo te panse anvan. Avans teknolojik yo kounye a mete limyè sou faktè ki kontwole fib misk skelèt yo. Anfèt, done nou yo sijere ke fib tip 2X yo ka pa yon soutip fib misk skelèt distenk. Anplis de sa, nou idantifye pwoteyin metabolik, pwoteyin ribozomal ak pwoteyin ki asosye ak selil kòm detèminan prensipal eterogeneite fib misk skelèt yo. Lè nou aplike workflow proteyomik nou an sou echantiyon pasyan ki gen myopati nematod, nou te demontre plis ke tipifikasyon fib ki baze sou MYH pa reflete nèt eterogeneite misk skelèt yo, sitou lè sistèm nan deranje. Anfèt, kèlkeswa kalite fib ki baze sou MYH la, myopati nematod lakòz yon chanjman nan direksyon pou fib ki pi rapid ak mwens oksidatif.
Yo te klase fib misk skelèt yo depi 19yèm syèk la. Analiz omik resan yo pèmèt nou kòmanse konprann pwofil ekspresyon diferan kalite fib MYH ak repons yo a diferan stimuli. Jan sa dekri isit la, apwòch omik yo genyen tou avantaj yon pi gwo sansiblite pou quantifye makè kalite fib pase metòd tradisyonèl ki baze sou antikò, san yo pa konte sou quantifikasyon yon sèl (oswa kèk) makè pou defini yon kalite fib misk skelèt. Nou te itilize workflows transkriptomik ak proteyomik konplemantè epi nou te entegre rezilta yo pou egzamine règleman transkripsyonèl ak pòs-transkripsyonèl eterogeneite fib nan fib misk skelèt imen yo. Workflow sa a te lakòz echèk pou idantifye fib pi bon kalite tip 2X nan nivo pwoteyin nan vastus lateralis nan gwoup jèn gason an sante nou an. Sa a konsistan avèk etid anvan sou yon sèl fib ki te jwenn <1% fib 2X pi nan vastus lateralis ki an sante, byenke sa a ta dwe konfime nan lòt misk nan lavni. Diferans ki genyen ant deteksyon fib 2X prèske pi nan nivo mRNA ak sèlman fib 2A/2X melanje nan nivo pwoteyin lan se yon mistè. Ekspresyon ARNm izofòm MYH la pa sirkadien,67 sa ki sijere ke nou pa gen anpil chans pou nou te "rate" siyal aparisyon MYH2 la nan fib 2X ki sanble pi nan nivo ARN lan. Yon eksplikasyon posib, byenke piman ipotetik, ta ka diferans nan estabilite pwoteyin ak/oswa ARNm ant izofòm MYH yo. Anfèt, pa gen okenn fib rapid ki 100% pi pou okenn izofòm MYH, epi li pa klè si nivo ekspresyon ARNm MYH1 nan seri 70-90% la ta lakòz yon abondans MYH1 ak MYH2 egal nan nivo pwoteyin lan. Sepandan, lè nou konsidere transkriptòm oswa pwoteyòm nan nèt, analiz gwoupman an ka idantifye avèk konfyans sèlman de gwoupman distenk ki reprezante fib misk skelèt dousman ak rapid, kèlkeswa konpozisyon MYH presi yo. Sa a konsistan avèk analiz ki itilize apwòch transkriptomik yon sèl nwayo, ki tipikman idantifye sèlman de gwoupman myonikleyè distenk. 68, 69, 70 Anplis, byenke etid pwoteyomik anvan yo te idantifye fib tip 2X, fib sa yo pa gwoupe separeman ak rès fib rapid yo epi yo montre sèlman yon ti kantite pwoteyin ki gen yon abondans diferan konpare ak lòt kalite fib ki baze sou MYH. 14 Rezilta sa yo sijere ke nou ta dwe retounen nan pwen de vi klasifikasyon fib misk nan kòmansman 20yèm syèk la, ki te divize fib misk skelèt imen yo pa an twa klas distenk ki baze sou MYH, men an de gwoup ki baze sou pwopriyete metabolik ak kontraktil yo. 63
Pi enpòtan toujou, yo ta dwe konsidere eterogeneite myofib yo sou plizyè dimansyon. Etid "omik" anvan yo te montre nan direksyon sa a, sijere ke fib misk skelèt yo pa fòme gwoupman disrè men yo ranje sou yon kontinyòm. 11, 13, 14, 64, 71 La a, nou montre ke, anplis diferans nan pwopriyete kontraktil ak metabolik nan misk skelèt, myofib yo ka diferansye pa karakteristik ki gen rapò ak entèraksyon selil-selil ak mekanis tradiksyon. Anfèt, nou te jwenn eterogeneite ribozòm nan fib misk skelèt ki kontribye nan eterogeneite endepandamman de kalite fib dousman ak rapid. Kòz fondamantal eterogeneite myofib sibstansyèl sa a, endepandamman de kalite fib dousman ak rapid, rete enkoni, men li ka montre òganizasyon espasyal espesyalize nan fasik misk ki reponn optimalman a fòs ak chaj espesifik,72 kominikasyon selilè oswa espesifik nan ògàn ak lòt kalite selil nan mikwoanviwònman misk la73,74,75 oswa diferans nan aktivite ribozòm nan myofib endividyèl yo. Anfèt, yo montre ke eteroplasmi ribozomal, swa atravè sibstitisyon paralog RPL3 ak RPL3L oswa nan nivo 2'O-metilasyon rRNA, asosye avèk ipètwofi misk skelèt76,77. Aplikasyon milti-omik ak espasyal konbine avèk karakterizasyon fonksyonèl myofib endividyèl yo pral fè plis avanse konpreyansyon nou sou byoloji misk nan nivo milti-omik la78.
Lè nou analize pwoteyom myofib endividyèl ki soti nan pasyan ki gen myopati nemalin, nou te demontre tou itilite, efikasite, ak aplikabilite pwoteyomik myofib endividyèl pou klarifye patofizyoloji klinik misk skelèt. Anplis, lè nou konpare travay nou an ak analiz pwoteyomik global la, nou te kapab demontre ke pwoteyomik myofib endividyèl bay menm pwofondè enfòmasyon ak pwoteyomik tisi global la epi li ogmante pwofondè sa a lè li pran an kont eterogeneite entèfib yo ak kalite myofib la. Anplis diferans yo te espere (byenke varyab) nan rapò kalite fib yo obsève nan myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 yo konpare ak temwen ki an sante yo,19 nou te obsève tou remodelasyon oksidatif ak ekstraselilè endepandamman de chanjman kalite fib ki medyatè pa MYH. Yo te deja rapòte fibwoz nan myopati nemalin TNNT1 yo.19 Sepandan, analiz nou an baze sou rezilta sa a lè li revele tou ogmantasyon nan nivo pwoteyin ki gen rapò ak estrès sekrete ekstraselilè, tankou aneksin, ki enplike nan mekanis reparasyon sarkolemal, nan myofib ki soti nan pasyan ki gen myopati nemalin ACTA1 ak TNNT1 yo.57,58,59 An konklizyon, ogmantasyon nan nivo aneksin nan myofib ki soti nan pasyan ki gen myopati nemalin ka reprezante yon repons selilè pou repare myofib ki gravman atrofi.
Malgre ke etid sa a reprezante pi gwo analiz omik misk antye sou yon sèl fib imen jiska prezan, li pa san limit. Nou te izole fib misk skelèt yo nan yon echantiyon patisipan relativman piti ak omojèn ak yon sèl misk (vastus lateralis la). Se poutèt sa, li enposib pou eskli egzistans popilasyon fib espesifik atravè kalite misk ak nan ekstrèm fizyoloji misk. Pa egzanp, nou pa ka eskli posibilite pou yon sou-gwoup fib ultra rapid (pa egzanp, fib 2X pi) parèt nan sprinter ak/oswa atlèt fòs ki trè antrene79 oswa pandan peryòd inaktivite miskilè66,80. Anplis de sa, gwosè echantiyon limite patisipan yo te anpeche nou envestige diferans sèks nan eterogeneite fib, paske rapò kalite fib yo li te ye diferan ant gason ak fanm. Anplis de sa, nou pa t kapab fè analiz transkriptomik ak pwoteyomik sou menm fib misk yo oswa echantiyon ki soti nan menm patisipan yo. Pandan nou menm ak lòt moun ap kontinye optimize analiz yon sèl selil ak yon sèl myofib lè l sèvi avèk analiz omik pou reyalize yon kantite echantiyon ki pi ba anpil (jan sa demontre isit la nan analiz fib ki soti nan pasyan ki gen myopati mitokondriyal), opòtinite pou konbine apwòch milti-omik (ak fonksyonèl) nan fib miskilè endividyèl vin aparan.
An jeneral, done nou yo idantifye epi eksplike faktè transkripsyonèl ak pòs-transkripsyonèl ki enfliyanse eterogeneite nan misk skelèt yo. Espesyalman, nou prezante done ki defye yon dogm ki la depi lontan nan fizyoloji misk skelèt ki asosye ak definisyon klasik kalite fib ki baze sou MYH la. Nou espere renouvle deba a epi finalman repanse konpreyansyon nou sou klasifikasyon ak eterogeneite fib nan misk skelèt yo.
Katòz patisipan blan (12 gason ak 2 fanm) te dakò volontèman pou patisipe nan etid sa a. Komite Etik Lopital Inivèsite Ghent (BC-10237) te apwouve etid la, li te konfòm ak Deklarasyon Helsinki 2013 la, epi li te anrejistre nan ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Karakteristik jeneral patisipan yo prezante nan Tablo Siplemantè 1. Apre yo fin jwenn konsantman enfòme vèbal ak alekri, patisipan yo te sibi yon egzamen medikal anvan yo te enklizyon final yo nan etid la. Patisipan yo te jèn (22-42 an), an sante (pa gen pwoblèm medikal, pa gen istwa fimen), epi yo te modere aktif fizikman. Yo te detèmine konsomasyon oksijèn maksimòm lan lè l sèvi avèk yon èrgomèt etap pa etap pou evalye kondisyon fizik jan sa te dekri deja. 81
Yo te kolekte echantiyon byopsi misk yo pandan yo t ap repoze ak a jeun twa fwa, ak yon entèval 14 jou. Paske yo te kolekte echantiyon sa yo kòm yon pati nan yon etid ki pi gwo, patisipan yo te konsome yon plasebo (laktoz), yon antagonis reseptè H1 (540 mg fexofenadine), oswa yon antagonis reseptè H2 (40 mg famotidine) 40 minit anvan byopsi a. Nou te deja demontre ke antagonis reseptè istamin sa yo pa afekte kapasite fizik misk skelèt yo pandan repoze81, epi yo pa t obsève okenn gwoupman ki gen rapò ak eta a nan graf kontwòl kalite nou yo (Figi Siplemantè 3 ak 6). Yo te kenbe yon rejim alimantè estanda (41.4 kcal/kg pwa kò, 5.1 g/kg idrat kabòn pwa kò, 1.4 g/kg pwoteyin pwa kò, ak 1.6 g/kg grès pwa kò) pandan 48 èdtan anvan chak jou eksperimantal, epi yo te konsome yon dejene estanda (1.5 g/kg idrat kabòn pwa kò) nan maten jou eksperimantal la. Anba anestezi lokal (0.5 ml 1% lidokayin san epinefrin), yo te pran byopsi misk nan misk vastus lateralis la lè l sèvi avèk aspirasyon perkutan Bergström.82 Echantiyon misk yo te imedyatman mete nan RNAlater epi yo te estoke yo a 4°C jiskaske yo te fè diseksyon manyèl fib la (jiska 3 jou).
Yo te transfere pake myofib ki fèk izole yo nan yon mwayen RNAlater fre nan yon plat kilti. Apre sa, yo te disseke myofib endividyèl yo manyèlman lè l sèvi avèk yon estereyomikwoskòp ak yon pensèt amann. Yo te disseke vennsenk fib nan chak byopsi, yo te peye atansyon espesyal pou chwazi fib ki soti nan diferan zòn byopsi a. Apre diseksyon an, yo te plonje chak fib dousman nan 3 μl nan yon tanpon liz (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) ki gen anzim proteinaz K ak DNaz pou retire pwoteyin ak ADN endezirab yo. Yo te kòmanse liz selilè ak retire pwoteyin/ADN nan yon ti toubiyon, vire likid la nan yon mikwosantrifij, epi enkubasyon nan tanperati chanm (10 min). Yo te enkube liza a nan yon siklè tèmik (T100, Bio-Rad) a 37°C pandan 5 min, 75°C pandan 5 min, epi answit estoke imedyatman nan -80°C jiskaske yo kontinye trete li.
Yo te prepare bibliyotèk ARN poliadenilé konpatib ak Illumina apati 2 µl lizat myofib lè l sèvi avèk Kit Preparasyon Bibliyotèk QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). Ou ka jwenn metòd detaye yo nan manyèl manifakti a. Pwosesis la kòmanse ak sentèz ADNc premye branch lan pa transkripsyon envès, pandan sa yo entwodui idantifikatè molekilè inik (UMI) ak kòd bar i1 espesifik pou echantiyon an pou asire rasanbleman echantiyon yo epi redwi varyabilite teknik pandan pwosesis en. ADNc ki soti nan 96 myofib yo answit rasanble epi pirifye ak pèl mayetik, apre sa yo retire ARN lan epi yo fè sentèz dezyèm branch lan lè l sèvi avèk amorseur o aza. Yo pirifye bibliyotèk la ak pèl mayetik, yo ajoute etikèt i5/i7 espesifik pou pisin lan, epi yo anplifye PCR. Yon dènye etap pirifikasyon pwodui bibliyotèk konpatib ak Illumina. Yo te evalye kalite chak pisin bibliyotèk la lè l sèvi avèk Kit Analiz ADN Ti Fragman Sansiblite Segondè a (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Baze sou kantifikasyon Qubit la, yo te rasanble pisin yo plis toujou nan konsantrasyon ekimolè (2 nM). Apre sa, yo te sekansye pisin ki te sòti a sou yon enstriman NovaSeq 6000 nan mòd estanda lè l sèvi avèk Twous Reyaktif NovaSeq S2 a (1 × 100 nikleyotid) ak yon chajman 2 nM (4% PhiX).
Pwosesis nou an baze sou pwosesis analiz done QuantSeq Pool Lexogen an (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Done yo te premye demultiplexe ak bcl2fastq2 (v2.20.0) ki baze sou endèks i7/i5 la. Apre sa, Lekti 2 te demultiplexe ak idemux (v0.1.6) ki baze sou kòd bar echantiyon i1 la epi sekans UMI yo te ekstrè ak umi_tools (v1.0.1). Lekti yo te koupe ak cutadapt (v3.4) nan plizyè tou pou retire lekti kout (<20 nan longè) oswa lekti ki gen sèlman sekans adaptè. Lekti yo te aliyen ak jenòm imen an lè l sèvi avèk STAR (v2.6.0c) epi fichye BAM yo te endekse ak SAMtools (v1.11). Lekti kopi yo te retire lè l sèvi avèk umi_tools (v1.0.1). Finalman, kontaj aliyman an te fèt lè l sèvi avèk featureCounts nan Subread (v2.0.3). Yo te fè kontwòl kalite a lè l sèvi avèk FastQC (v0.11.9) nan plizyè etap entèmedyè nan pwosesis la.
Tout lòt pwosesis ak vizyalizasyon byoenformatik yo te fèt nan R (v4.2.3), sitou lè l sèvi avèk workflow Seurat (v4.4.0) la. 83 Se poutèt sa, valè UMI endividyèl yo ak matris metadone yo te transfòme an objè Seurat. Jèn ki te eksprime nan mwens pase 30% nan tout fib yo te retire. Echantiyon ki pa gen bon kalite yo te retire sou baz yon papòt minimòm 1000 valè UMI ak 1000 jèn detekte. Finalman, 925 fib te pase tout etap filtraj kontwòl kalite. Valè UMI yo te nòmalize lè l sèvi avèk metòd Seurat SCTransform v2 la, 84 ki gen ladan tout 7418 karakteristik detekte yo, epi diferans ant patisipan yo te regrese. Tout metadone ki enpòtan yo ka jwenn nan Ansanm Done Siplemantè 28 la.